魚(yú)配合飼料中氯霉素殘留量的檢測(cè)方法

羅靳

摘要：研究了一種相比于GB/T 21108-2007《飼料中氯霉素的測(cè)定 高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法》前處理步驟相對(duì)簡(jiǎn)單的方法測(cè)定魚(yú)配合飼料，采用內(nèi)標(biāo)法定量，添加0.1 μg/kg、0.3 μg/kg、1.0 μg/kg、5.0 μg/kg四個(gè)濃度，回收率在90.2%～119.9%。氯霉素在0.1～20.0 ng/mL范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好，R2>0.999，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）<6%，滿(mǎn)足GB/T 27404-2008以及GB/T 21108-2007對(duì)回收率和精密度的所有要求。通過(guò)計(jì)算得到方法檢出限（LOD）為0.002 μg/kg，方法定量限（LOQ）為0.006 μg/kg。

關(guān)鍵詞：氯霉素檢測(cè)，魚(yú)配合飼料，檢測(cè)方法研究，液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法

氯霉素屬?gòu)V譜抗生素，它通過(guò)與核糖體的50S亞單位結(jié)合，而抑制細(xì)菌蛋白質(zhì)的合成。對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌均有較好的抑制作用，對(duì)立克次體、衣原體也有抑制作用。因其效高價(jià)廉，曾在水產(chǎn)、畜牧業(yè)中廣為應(yīng)用。但氯霉素有較強(qiáng)的毒副作用和毒性，長(zhǎng)期應(yīng)用可導(dǎo)致再生障礙性貧血和粒細(xì)胞缺乏癥。如果氯霉素在食用動(dòng)物中殘留，可通過(guò)食物鏈傳給人類(lèi)，對(duì)人類(lèi)的健康造成危害。目前檢測(cè)飼料中氯霉素的方法有氣相色譜-質(zhì)譜法[1-3]、液相色譜-質(zhì)譜法[4-6]和酶聯(lián)免疫法[7-8]。本實(shí)驗(yàn)參考GB/T 20756-2006等方法[5-6，9-10]研究出一種前處理步驟相對(duì)簡(jiǎn)單的液相-質(zhì)譜法用于檢測(cè)魚(yú)配合飼料，降低了不確定度，并且縮短了檢測(cè)時(shí)間，提高了檢測(cè)效率。

1材料與方法

1.1主要試劑

氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品均購(gòu)自Dr.Ehrenstorfer Gmb公司，純度≥98.5% Lot No.90424，氘代氯霉素（chloramphenicol-D5）購(gòu)自Dr.Ehrenstorfer GmbH Lot No.30417AC 100 μg/mL。乙酸乙酯，F(xiàn)isher ，色譜純；正己烷，沃凱，色譜純；實(shí)驗(yàn)用水為Mili-Q制得的電導(dǎo)率18.2Ω的超純水。

1.2主要儀器

IKA分析研磨機(jī)；湘儀離心機(jī)TDAA-WS；0.22 μm微孔濾膜；EYELA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；日立高速冷凍離心機(jī) HITACHI CF16RXⅡ；HPLC system：Agilent 1200 series，Agilent 6410 LC/MS/MS Agilent6410a 串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜儀，配有電噴霧離子源（ESI）；ZORBAX SB-C18，150 mm×2.1 mm（i.d.），5 μm Agilent。

1.3試驗(yàn)部分

1.3.1標(biāo)準(zhǔn)溶液配制[9]準(zhǔn)確稱(chēng)取10.00 g氯霉素，用乙腈溶解并定容至100 mL容量瓶，得到100 μg/mL氯霉素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液；準(zhǔn)確吸取 1 mL氯霉素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液乙腈定容至100 mL，得到1 μg/mL氯霉素標(biāo)準(zhǔn)中間液；準(zhǔn)確吸取1 mL氯霉素標(biāo)準(zhǔn)中間液，純水定容50 mL，得到20 ng/mL氯霉素標(biāo)準(zhǔn)工作液。

準(zhǔn)確吸取100 μg/mL氘代氯霉素內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液 100 μL乙腈定容至10 mL，得到1 μg/mL氘代氯霉素內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)中間液 ；準(zhǔn)確吸取1 mL氘代氯霉素內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)中間液純水定容50 mL，得到20 ng/mL氘代氯霉素標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.3.2樣品前處理魚(yú)配合飼料樣品用IKA分析研磨機(jī)磨成細(xì)粉，準(zhǔn)確稱(chēng)取5.00 g±0.001 g于50 mL具塞離心管中，加入20 ng/mL氘代氯霉素250 μL，加入15 mL乙酸乙酯，混勻，振搖15 min，4 000r/min離心8 min，取出上清，再用15 mL乙酸乙酯重新提取一次，合并上清，45 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，5 mL水溶解，10 mL正己烷除脂兩次，靜止分層，取下層水相12 000 r/min 4 ℃冷凍離心后過(guò)0.22 μm水相有機(jī)相串聯(lián)濾膜，得到樣品用于液相串聯(lián)質(zhì)譜儀器測(cè)定。

1.3.3液質(zhì)聯(lián)用儀分析條件[10]

1.3.3.1色譜條件 色譜柱ZORBAX SB-C18，150 mm×2.1 mm（i.d.），5 μm Agilent，進(jìn)樣量為20 μL；柱溫30 ℃；流動(dòng)相為A去離子水、B乙腈；梯度洗脫條件見(jiàn)表1。

1.3.3.2質(zhì)譜條件采用電噴霧離子源（ESI），負(fù)離子掃描，Capillary：4 000 V，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）方式檢測(cè)，干燥氣N2，干燥氣溫度350 ℃，霧化氣壓力35psi，優(yōu)化質(zhì)譜條件見(jiàn)表2，氯霉素及氘代氯霉素的MRM色譜圖和其定性定量離子質(zhì)譜圖見(jiàn)圖1、圖2。

1.4線(xiàn)性范圍、檢出限和定量限

配制9個(gè)不同質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，溶液中氯霉素為0.0、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0 ng/mL，氘代氯霉素的質(zhì)量濃度為1.0 ng/mL，測(cè)定峰面積，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積的比值（氯霉素峰面積/氘代氯霉素-D5面積）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。在空白配合飼料中添加氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品以信噪比（S/N）≥3時(shí)的含量定為方法的檢出限（LOD）；以信噪比（S/N）≥10時(shí)的含量定為方法的檢量限（LOQ）。

1.5回收率的測(cè)定

選取陰性魚(yú)配合飼料樣品，添加氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品和內(nèi)標(biāo)，氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品添加水平為0.1 μg/kg、0.3 μg/kg、1.0 μg/kg、5.0 μg/kg，氘代氯霉素 1.0 μg/kg，每個(gè)添加水平9次平行。

2試驗(yàn)結(jié)果

2.1線(xiàn)性范圍、檢出限和定量限

針對(duì)不同的添加濃度選擇相應(yīng)的濃度擬合成兩條曲線(xiàn)，進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。針對(duì)添加濃度為0.1 μg/kg、0.3 μg/kg、1.0 μg/kg，選擇CAP濃度為0.0 ng/mL、0.1 ng/mL、0.2 ng/mL、0.5 ng/mL、1.0 ng/mL、2.0 ng/mL擬合成一條標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，曲線(xiàn)方程y=0.841 966x+0.011 336，R2=0.999 807 50。針對(duì)添加濃度為5.0 μg/kg，選擇CAP濃度為0.0 ng/mL、0.1 ng/mL、1.0 ng/mL、2.0 ng/mL、5.0 ng/mL、10.0 ng/mL、20.0 ng/mL擬合成一條標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，曲線(xiàn)方程y=0.902 543 x-0.007 240 3，R2=0.999 840 61。數(shù)據(jù)顯示CAP在0.1～20.0 ng/mL范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好，R2>0.999。根據(jù)添加量為0.5 ng/mL的9個(gè)樣品152定量離子的最低信噪比和計(jì)算公式3C/（S/N），計(jì)算理論方法檢出限（LOD）為0.002 μg/kg，理論方法定量限為（LOQ）為0.006 μg/kg。

2.2回收率和精密度

針對(duì)不同添加量，其回收率和RSD見(jiàn)表3。

所有數(shù)據(jù)都滿(mǎn)足GB/T 27404-2008[11]以及GB/T 21108-2007[4]對(duì)回收率和精密度的所有要求。

2.3實(shí)際樣品的檢測(cè)

利用該方法對(duì)12個(gè)魚(yú)配合飼料樣品進(jìn)行檢測(cè)，均為未檢出。

3討論

3.1前處理方法的優(yōu)化

GB/T 21108-2007方法中包括提取—液-液分配凈化—濃縮—溶解—SPE柱凈化—濃縮—溶解，步驟繁瑣，導(dǎo)致回收率偏低，不確定度增加，且效率降低。而本實(shí)驗(yàn)方法只包括提取—濃縮—溶解—除脂四個(gè)簡(jiǎn)單步驟，整個(gè)過(guò)程幾乎無(wú)損耗，大大提高了回收率，降低了不確定度，并且縮短了檢測(cè)時(shí)間，提高了檢測(cè)效率。

3.2雜質(zhì)峰的去除及除脂方法優(yōu)化

本實(shí)驗(yàn)還嘗試將乙酸乙酯提取后的上清液直接進(jìn)行液相串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果有雜峰干擾，于是濃縮后加入10 mL正己烷除脂，結(jié)果證明雜峰已去除，但是樣品本身還殘留有魚(yú)飼料的黃色，正己烷再次除脂一次，樣品已經(jīng)變成清亮白色，液相串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)得到單一目的峰，峰形尖銳，無(wú)雜峰或拖尾現(xiàn)象。見(jiàn)圖1。

3.3方法檢出限和定量限

雖然根據(jù)計(jì)算得到方法檢出限（LOD）為0.002 μg/kg，相比于GB/T 201108-2007方法的最低檢測(cè)濃度5 μg/kg縮小了2 500倍，但它只是理論值，若將0.002 μg/kg添加到飼料中，采用這種方法檢測(cè)在回收率和精密度方面是否符合要求將有待于進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。但是本實(shí)驗(yàn)的最低添加量0.1 μg/kg在回收率和精密度方面都符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)要求，并且相比于GB/T 201108-2007方法的最低檢測(cè)濃度縮小了50倍。

4結(jié)語(yǔ)

本文研究了一種相對(duì)于GB/T 21108-2007前處理步驟簡(jiǎn)單的方法測(cè)定魚(yú)配合飼料，采用內(nèi)標(biāo)法定量，省略了液-液分配凈化—濃縮—溶解—SPE柱凈化步驟，相應(yīng)地降低了不確定度，同時(shí)提高了檢測(cè)效率。

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（收稿日期：2015-06-15）