液質質串聯質譜法測定淡水及沉積物中硝基呋喃類代謝物

陳永平等

摘要：改進了淡水水體和沉積物中4種硝基呋喃代謝物呋喃唑酮代謝物（AOZ）、呋喃它酮代謝物（AMOZ）、呋喃妥因代謝物（AHD）、呋喃西林代謝物（SEM）的高效液相色譜串聯質譜（LC-MS/MS）檢測方法。方法采用內標法定量，提高了定量的準確性。水及沉積物樣品直接進行衍生化后乙酸乙酯提取，化合物采用Thermo C18（5.0 μm，100 mm×2.1 mm）色譜柱進行分離，以0.1%甲酸/甲醇-5 mmol/L乙酸銨水溶液（含0.1%甲酸）為流動相梯度洗脫。方法的線性范圍為0.1～200 ng/mL，r2≥0.999。空白水體在0.02、1.0、10.0 ng/L 3個加標水平下的平均回收率為75.4%～82.7%，相對標準偏差（RSD）為3.2%～8.7%，檢出限（LOD）和定量下限（LOQ）分別為0.01 ng/mL和0.02 ng/mL。沉積物樣品在0.3、1.0、10 μg/kg 3個加標水平下，平均回收率為77.9%～93.6%，RSD為2.5%～7.8%，檢出限（LOD）和定量下限（LOQ）分別為0.1 μg/kg和0.3 μg /kg。該方法靈敏度高、選擇性好，適用于實際淡水養殖環境水體和底泥中4 種硝基呋喃代謝物呋喃唑酮代謝物的殘留測定。

關鍵詞：LC-MS/MS；淡水；沉積物；硝基呋喃代謝物

硝基呋喃是人工合成的廣譜抗生素，因其對革蘭氏細菌體內的氧化還原系統進行干擾被廣泛用于預防和治療此類細菌引起的腸胃道疾病[1-2]，原藥經機體代謝產生的代謝物一部分與生物機體細胞膜蛋白結合成結合態，穩定存在于動物機體內，另一部分被排泄到體外，直接散布到養殖水體中，或沉積到池塘底部，隨著時間的推移，被代謝物污染的水體或被排放到其他養殖區域，造成水體的二次污染，沉積到池塘底部的藥物可能永久殘存，只能靠單純的自然降解來消除[3-7]。研究發現硝基呋喃類藥物及其代謝物具有強的致癌致畸致突變等毒副作用，國內加大了對其代謝物的監控力度，但監控范圍主要針對當前上市或產地水產品，還沒有涉及到養殖環境監測。原因一方面養殖環境水體及沉積物中硝基呋喃類代謝物檢測技術不夠成熟，另一方面環境中的藥物與生物體內的藥物殘留相關性了解不夠清楚。監控不利導致環境中的藥物再次被生物體吸收、富集殘存在體內，因此從擴大監控范圍，從根源消除代謝物殘留十分必要。目前文獻主要報道了水產品中硝基呋喃類代謝物檢測技術[8]，淡水及沉積物中的硝基呋喃類代謝物的測定未見報道。

本文研究采用對于淡水養殖水體及沉積物直接衍生提取，過微濾膜，采用高效液相色譜串聯質譜對其進行測定，具有高效、靈敏、穩定的特性，可作為養殖環境的監控手段。

1實驗部分

1.1儀器與試劑

AB 4000 Qtrap三重四極桿質譜（AB Sciex），電子天平（MettLer ToLedo 公司）；高速冷凍離心機（Sigma公司）；高速組織勻漿機（飛利浦公司 轉速10 000 r/min），MS1 Mini-shaker 渦輪振蕩器（IKA 公司）；MiLLi-Q純水器（MiLLipore 公司）；氮吹儀（Organomation Associates 公司）；移液器（10、20、100、200、1000 μL，Eppendorf 公司）。

AHD、SEM、AMOZ、AOZ 標準品（德國Dr.Ehrenstorfer 公司）；AHD-13C3、SEM-15N13C、AMOZ-D5、AOZ-D4（德國Dr.Ehrenstorfer 公司）；二甲基苯甲醛（色譜純，天津四友科技有限公司）；甲醇（質譜純，Thermo 公司）；正己烷（色譜純，天津科密歐化學試劑有限公司）；乙酸銨（色譜純，天津四友科技有限公司）；甲酸（色譜純，科密歐公司）；濃鹽酸（優級純，天津四友有限公司）；磷酸氫二鉀（ 分析純，天津光復科技發展有限公司）。

1.2溶液配制

1.2.10.002 moL/L醋酸銨溶液稱取0.15 g醋酸銨，用水溶解并定容至1 000 mL。

1.2.2甲醇溶液甲醇∶水=5∶95（V/V）。

1.2.30.2 moL/L鹽酸溶液量取濃鹽酸（ρ=1.19 g/mL）18.0 mL，用水稀釋至1 000 mL。

1.2.40.05 moL/L 2-硝基苯甲醛溶液稱取0.037 8 g 2-硝基苯甲醛，溶于5 mL二甲亞砜中，現用現配。

1.2.5磷酸氫二鉀溶液1.0 moL/L。稱取87.1 g磷酸氫二鉀，溶解于500 mL水中。

1.2.6同位素內標儲備液AOZ-D4、AMOZ-D5、AHD-13C3和SEM·HCl-13C -15N2，濃度均為100 μg/mL。分別準確稱取10.0 mg AOZ-D4、AMOZ-D5、AHD-13C3和SEM·HCl-13C-15N2內標標準物質，用甲醇溶解并定容至10 mL棕色容量瓶中，配成濃度為1.0 mg/mL內標標準儲備液，-20℃冷凍保存。

1.2.7AOZ標準儲備溶液1.0 mg/mL。準確稱取10.0 mg AOZ，用甲醇溶解避光定容至10 mL棕色容量瓶中，-20℃冷凍保存。

1.2.8AMOZ標準儲備溶液1.0 mg/mL。準確稱取10.0 mg AMOZ，用甲醇溶解并定容至10 mL棕色容量瓶中，-20 ℃冷凍保存。

1.2.9SEM標準儲備溶液1.0 mg/mL。準確稱取14.9 mg SEM·HCl，用甲醇溶解并定容至10 mL棕色容量瓶中，-20 ℃冷凍保存。

1.2.10AHD標準儲備溶液1.0 mg/mL。準確稱取13.2 mg AHD·HCl，用甲醇溶解并定容至10 mL棕色容量瓶中，-20 ℃冷凍保存。

1.3樣品前處理

1.3.1養殖淡水水樣取水樣10 mL于50 mL塑料離心管中，加入硝基呋喃代謝物內標50μL（100 ng/mL），加入6.0 mL鹽酸溶液，再加入200 μL衍生試劑，漩渦2 min，置于恒溫水浴振蕩器上35 ℃避光振蕩約16 h，取出離心管冷卻至室溫后，加入5.0 mL磷酸氫二鉀溶液，加入10 mL乙酸乙酯，漩渦2 min，以10 000 r/min離心3 min，于40 ℃氮氣吹至近干，殘渣用1.0 mL流動相溶解，過0.2 μm濾膜，待上機。

1.3.2沉積物樣品取風干后的沉積物樣品5.0 g于50 mL塑料離心管中，加入硝基呋喃代謝物內標50 μL（100 ng/mL），再加入200 μL的衍生試劑，加入5.0 mL鹽酸溶液，漩渦2 min，然后置于恒溫水浴振蕩器上35 ℃避光振蕩約16 h，取出離心管冷卻至室溫后，加入5.0 mL磷酸氫二鉀溶液，加入10.0 mL乙酸乙酯，漩渦2 min，以10 000 r/min離心5 min，于40 ℃氮氣吹至近干，殘渣用1.0 mL流動相溶解，過0.2 μm濾膜，待上機。

1.4儀器分析條件

1.4.1色譜條件

2結果與討論

2.1色譜質譜條件的選擇

流動相無機相選擇水相中加入一定量乙酸銨（5 mmoL·L-1），再加入一定量甲酸（0.1%），增強各化合物離子化效果，目的是為了增加各組分的保留時間，改善各組分的峰形。流動相有機相選擇甲醇和乙腈作對比實驗，結果表明甲醇和水相配合做流動相時，化合物分離效果較好。

取衍生好的四種硝基呋喃代謝物100 ng·mL-1標準溶液，用蠕動泵將四種代謝物的衍生溶液注入離子源，在ESI（+）離子化模式下，分別對噴霧電壓、離子源溫度、GAS1、GAS2、碰撞能量等條件進行優化，優化參數見表1。

2.2色譜柱的選擇

分別選擇Thermo C18柱（5μm， 100×2.1 mm i.d.），島津 C8柱（2.1 μm， 100×2.1 mm i.d.），Agilent C18柱（5μm， 100×4.6 mm i.d.）以乙酸銨溶液、甲醇為流動相梯度洗脫，Thermo C18柱出峰分離效果均好于島津 C8柱、Agilent C18柱，最終實驗選擇Thermo C18柱（5μm， 100×2.1 mm i.d.）作為四種代謝物分離色譜柱。

2.3衍生化時間的選擇

實驗設計在沉積物中添加同一濃度（1.0 μg/Kg）的四種硝基呋喃代謝物，加入2-硝基苯甲醛（0.05 moL/L）150、200μL，參考相關文獻溫度設定為35、37 ℃，衍生化時間設定為2 h、4 h、6 h、8 h、12 h、16 h、18 h、20 h，結果表明衍生化試劑為200 μL、35 ℃條件下衍生16 h時衍生化最充分、衍生物最穩定。

2.4方法的標準曲線與靈敏度

通過優化，用內標法定量四種呋喃類代謝物的線性范圍，結果顯示兩者質量濃度均在0.2～200 ng/mL 范圍內與峰面積呈良好的線性關系，r2 大于0.999。回收率均大于80%，按S/N>3計算得該方法在環境水樣和底泥樣品中的檢出限（ LOD） 分別為0.01 ng /mL 和0.1μg /kg，以信噪比S/N>10得其定量下限（LOQ）分別為0.02 ng /mL和0.3 μg /kg。

2.5方法的回收率與精密度

在空白環境水樣中四類呋喃類代謝分別添加0.02、1.0、10.0 ng/L 3個濃度梯度，沉積物中四類呋喃類代謝分別添加0.3、1.0、10.0 μg/kg 3個濃度梯度，同時每個濃度的實驗重做五次，按照本方法處理后測定，回收率和相對標準偏差見表3。沉積物中AOZ的平均回收率為77.9%～88.4%，RSD 為2.5%～7.2%，AMOZ的平均回收率為86.6%～90.8%，RSD 為1.9%～7.8%，SEM的平均回收率為90.4%～92.5%，RSD 為3.5%～6.2%，AHD的平均回收率為87.3%～93.6%，RSD 為1.4%～4.6%；水體AOZ的平均回收率為77.9%～88.4%，RSD 為3.2%～6.1%，AMOZ的平均回收率為76.2%～78.6%，RSD 為3.3%～7.3%，SEM的平均回收率為78.8%～81.3%，RSD 為2.9%～8.4%，AHD的平均回收率為76.8%～82.7%，RSD 為5.7%～8.7%。因此，本方法具有較高的準確性、靈敏性、穩定性。

3結論

本文通過優化淡水及沉積物中四種硝基呋喃類代謝物提取凈化、色譜質譜條件，改進了水產養殖環境淡水水體和沉積物中呋喃類代謝物殘留測定方法。結果表明，本方法在0.2～200 ng/mL 范圍內呈現良好的線性關系，水體和沉積物中的定量限分別為0.02 ng/mL和0.3 μg/kg?？勺鳛榈w和沉積物中呋喃類代謝物殘留的檢測方法，成果應用可為養殖環境中代謝物監控，生物體與養殖環境之間相關性分析及環境安全評價提供分析手段，也為水產品中藥物溯源提供技術支持。

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