豬日本乙型腦炎病毒DNA復制子載體的構建及外源基因表達分析

王曉杜，趙凡凡，，代 兵，邵東華，蔣春英，周 圻＊，馬志永＊

（1.浙江農林大學動物科技學院，臨安300311；2.中國農業科學院上海獸醫研究所，上海200241）

病毒復制子指完全或部分去除病毒結構蛋白基因，保留與復制相關的非結構蛋白基因的病毒亞基因組，該亞基因組具有自主復制并表達病毒自身非結構蛋白及插入的外源蛋白質的能力，但是不包裝出具有感染性的病毒粒子。病毒復制子不僅是研究病毒基因結構與功能技術平臺，也是表達外源蛋白質［1］及研發疫苗的新型手段［2］。目前報道已經構建成功的復制子有甲病毒、小RNA病毒、黃病毒、冠狀病毒等RNA病毒的復制子，其中研究最為成熟的是甲病毒復制子，已作為真核表達載體研制成功，并且進行商業化生產。雖然以甲病毒復制子為基礎的新型疫苗能較好的產生免疫力，保護動物免受感染［3］，然而甲病毒復制子對細胞毒性較強而導致細胞很快發生凋亡，所以其不能持續表達外源蛋白質。黃病毒復制子能克服上述缺點，主要表現在以下幾個方面：由于黃病毒復制子細胞毒性很小，能在細胞內復制數十天；另外黃病毒屬病毒的RNA聚合酶保真性較高而保證黃病毒屬病毒復制子作為疫苗載體時免疫原性較穩定；黃病毒屬病毒復制子的RNA相對較小，便于遺傳操作［4］。因此，黃病毒屬病毒復制子的研究將在基礎研究和疫苗開發研究方面極具價值。

豬日本乙型腦炎病毒（Japanese encephalitis virus，JEV）是黃病毒科（Flaviviridaefamily）黃病毒屬（Flavivirus）重要的成員之一，同屬病毒還包括黃熱病毒（yellow fever virus，YFV）、蜱傳腦炎病毒（tick－borne encephalitis virus，TBEV）和登革熱病毒（Dengue virus，DENV）等。JEV 病毒粒子直徑約50nm，病毒基因組為單股正鏈RNA，長約11 kb，包含一大的開放閱讀框，合成一條長的肽鏈，在細胞內蛋白酶的作用下，合成病毒的結構蛋白（C）、基質蛋白（prM）、囊膜蛋白（E）和7個非結構蛋白（NS1、NS2A、NS2B，NS3，NS4A，NS4B，NS5）［5］。JEV基因組5′端有I型帽子結構（m7GpppAmp），3′端不攜帶多聚腺苷酸尾?；蚪M5′和3′末端核苷酸都可形成高度保守的二級結構，其與病毒的復制密切相關［6］，NS3、NS5基因編碼的復制酶復合體對病毒基因組復制和蛋白質翻譯是必須的。作者通過改造本課題組前期構建的JEV弱毒株SA14－14－2感染性克隆，去除其部分結構基因（prM及E），構建以CMV為啟動子的JEV復制子載體pAC－JEV，插入外源基因，驗證該載體具有自主復制能力和外源蛋白質表達效果，為開發新型疫苗和研究JEV的復制機制提供技術基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

含有JEV疫苗株SA14－14－2的基因片段質粒pK－JEV由作者實驗室提供；質粒pBluescript SK2（＋）、pcDNA3.1（＋）、pEGFP－N1、低拷貝質粒pACYC－177由作者實驗室保存；小鼠抗JEV多克隆抗體由作者實驗室制備。

主要試劑：RT－PCR試劑盒、rTaq酶、限制性內切酶購自 TaKaRa公司；Lipofectamine 2000、FITC－羊抗小鼠IgG、HRP－羊抗小鼠酶IgG、各種血清和細胞培養用培養基購自Invitrogen公司；質粒提取試劑盒、DNA片段膠回收試劑盒、DNA片段快速純化試劑盒購自Xygen公司；常規試劑為國產分析純。

1.2 含CMV啟動子的JEV復制子載體pAC－JEV的構建

JEV復制子載體pAC－JEV、NS5缺失載體pAC－JEV－△NS5的結構如圖1。構建方法如下：以低拷貝質粒pACYC－177為骨架，引入新的酶切位點（HindⅢ －EcoRⅠ－KpnⅠ－SalⅠ－XbaⅠ－XhoⅠ），將CMV啟動子插入新引入的酶切位點HindⅢ－EcoRⅠ間；之后分別將JEV結構蛋白C基因、FMDV 2A插入EcoRⅠ和KpnⅠ酶切位點間，命名該質粒為pAC－CMV－CF2A；再以pK－JEV為模板，用NSⅠ－F及NSⅠ－R擴增JEV非結構蛋白NSⅠ，用NSⅡ－F及 NSⅡH－R1／R2／R3采用延伸PCR方法獲得NSⅡ＋HDVRz融合片段，將2個片段保存于－20℃備用。利用XbaⅠ和XhoⅠ將NSⅡ＋HDVRz連接到pBluescript SK2（＋）上并命名為pBlue－NSⅡ＋HDVRz，以NheⅠ和XhoⅠ為酶切位點將polyA連接到pBlue－NSⅡ＋HDVRz，連接產物鑒定正確后經XbaⅠ和XhoⅠ雙酶切再連接到pAC－CMV－CF2A 上，將其命名為 pAC－exJEV，最后利用SalⅠ和XbaⅠ將NSⅠ連接到pAC－exJEV上，將最終的復制子載體命名為pAC－JEV。為了證明pAC－JEV的自主復制能力，利用突變PCR的方法，使得pAC－JEV的NS5基因缺失，構建pACJEV－ΔNS5質粒。擴增相關序列引物見表1。

表1 擴增引物序列Table 1 Primers for constructing the subgenomic replicon of JEV

1.3 轉染BHK－21細胞

利用pAC－JEV質粒，將質粒（2μg）轉染BHK－21細胞，具體方法參照Lipofectamine 2000說明書。通過方陣試驗確定質粒與脂質體用量的最佳比值，之后將質粒染至24孔板單層BHK－21細胞，以pACYC－177空質粒為陰性對照。

1.4 含EGFP報告基因復制子的構建及表達檢測

以pEGFP－N1為模板，設計合成兩條引物EGFP－F／R（表1），PCR 擴增獲得EGFP基因，利用KpnⅠ和SalⅠ雙酶切與pAC－JEV、pAC－exJEV相連接并命名為 pAC－JEV－EGFP、pAC－exJEV－EGFP，測序驗證后，Lipofectamine 2000轉染 BHK－21，同時以空載體pACYC－177為陰性對照，并在轉染后12h開始，每隔24h在熒光顯微鏡下觀察熒光變化。

1.5 Real－time PCR檢測復制子中EGFP 的轉錄能力

重組載體pAC－JEV－EGFP、pAC－exJEV－EGFP分別轉染BHK－21細胞，轉染后24、48、72、96h收取細胞樣品提取RNA，經DNaseⅠ消化后取1μg總RNA進行反轉錄PCR反應。熒光定量PCR檢測EGFP基因片段引物序列，F：5′－AAGCAGAAGA－ACGGCATCAAGG－3′；R：5′－CACGAACTCCAGCAGGACCATG－3′。對每個樣品設定3次重復，以GAPDH作為內參基因，相對定量方法計算其RNA量的相對轉錄量。

1.6 IFA和Western blotting檢測復制子非結構蛋白的表達

將細胞傳代于放置蓋玻片的30mm細胞培養皿中，細胞長至90%時轉染pAC－JEV質粒4μg。分別于轉染后24、48、72h收取相應時間點的蓋玻片，陰性對照和陽性對照72h收取。IFA操作過程：細胞片經甲醇∶冷丙酮（1∶1）－20℃固定20 min，PBS洗滌3次，1%BSA 37 ℃封閉30min，PBS清洗3次，每次10min；用1∶50稀釋的小鼠抗JEV多抗37℃孵育1h，PBS洗5次，每次10min；用1∶500稀釋的FITC－羊抗小鼠IgG為二抗37℃孵育30min，TBS洗3次，每次10min；1×DAPI室溫染色10min，TBS清洗3次之后用封片劑將蓋玻片固定于載玻片上，熒光顯微鏡觀察。

用 Lipofectamine 2000 轉 染 pAC－JEV、pACJEV－△NS5（圖1）、pACYC－177、pAC－JEV－HA、pAC－JEV－GP5質粒至30mm 內BHK－21細胞中，以感染JEV細胞為陽性對照，正常細胞為陰性對照。72h收取細胞樣品，離心沉淀細胞。裂解液和超聲破碎提取細胞總蛋白質，BCA法測蛋白質濃度。取20μg總蛋白質進行SDS－PAGE電泳，之后將蛋白質電轉至NC膜進行 Western blotting。將NC膜在小鼠抗JEV NS3（1∶1 000稀釋）多抗中4℃孵育過夜，TBST洗5次，每次5min；羊抗小鼠HRP酶標記的二抗（1∶5 000稀釋）室溫孵育1h，TBST洗3次，每次5min，ECL試劑盒進行顯影，并把顯出來的膠片進行計算機掃描，保存和編輯圖片。

圖1 復制子及相關載體結構示意Fig.1 Schematic diagram of construction of the subgenomic replicon vector

2 結 果

2.1 JEV復制子相關載體pAC－exJEV、pAC－JEV、pAC－JEV－△NS5、pAC－JEV－EGFP、pAC－exJEV－EGFP、pAC－JEV－HA 和GP5、pAC－JEV－△NS5－HA 和GP5的構建

將CMV啟動子、HDVRz、PolyA終止子等元件引入質粒pACYC－177中，在課題組此前構建的JEV感染性克隆的基礎上，去除JEV結構蛋白prM和E，構建了保留全部非結構蛋白的JEV復制子載體pAC－JEV（圖1）。為方便后續試驗的對照，再通過PCR方法缺失掉NS5羧基端部分基因序列而構建的質粒pAC－JEV－△NS5（圖1）。在pAC－exJEV和pAC－JEV復制子的基礎上，利用KpnⅠ和SalⅠ酶切位點，引入GFP、HA、GP5基因，構建pACJEV－EGFP、pAC－exJEV－EGFP、pAC－JEV－HA、pAC－JEV－GP5質 粒，在 pAC－JEV－△NS5 的 基 礎上，插入HA、GP5基因構建pAC－JEV－△NS5－HA、pAC－JEV－△NS5－GP5質粒。以上構建的質粒均通過酶切、測序鑒定無誤后進行下一步試驗。圖1展示了部分質粒構建示意。

2.2 IFA驗證復制子非結構蛋白的表達情況

將pAC－JEV轉染至BHK－21細胞，分別在24、48、72h取出蓋玻片，以小鼠抗NS3抗體為一抗，進行IFA檢測。試驗結果表明，24h時大多數細胞已經表達JEV的NS3蛋白（圖2A），病毒蛋白質位于細胞質；隨著時間的延長，熒光的亮度有所增加（圖2A～C），說明JEV復制子具有自主復制能力。陽性對照組（JEV感染48h）幾乎全部細胞都有較強的熒光信號（圖2D）；而陰性對照組（轉染pAC－exJEV質粒）細胞內無熒光信號（圖2E）。該結果表明pAC－JEV復制子具有自我復制能力。

2.3 Western blotting 檢測復制子 pAC－JEV 的非結構蛋白表達

載體pAC－JEV、pAC－JEV－ΔNS5分別轉染BHK－21，同時設置陽性（JEV感染48h）、陰性對照組（空白的BHK－21細胞），轉染96h后收取細胞樣品進行 Western blotting，β－actin作為蛋白質樣品上樣量對照。結果表明：轉染96h后，pAC－JEV復制子載體還能表達JEV NS3蛋白（圖3），而對照的pAC－JEV－ΔNS5質粒轉染的細胞中，由于NS5（JEV復制的重要酶）的缺失，復制子的亞基因組復制能力受阻，NS3也就無法進行表達。該試驗進一步證明復制子pAC－JEV具有自我復制能力。

2.4 pAC－JEV－EGFP復制子表達報告基因EGFP

復制子載體pAC－JEV和帶有報告基因EGFP的pAC－JEV－EGFP質粒各2μg，依據轉染試劑盒說明書上的方法，利用Lipofectamine 2000，將質粒轉染進BHK－21細胞，轉染后每隔12h，將轉染樣品置熒光顯微鏡下觀察一次，連續觀察8d。結果顯示：轉染12h后即出現綠色熒光，該熒光可持續8d左右（圖4），并且熒光亮度逐漸增加，但是由于細胞培養時間的延長，期間發現部分陽性細胞變圓死亡現象。該試驗說明復制子載體pAC－JEV具有表達外源基因的能力。

2.5 Real－time PCR驗證JEV復制子表達外源基因的能力

JEV 復制子 pAC－JEV－EGFP和 pAC－exJEVEGFP轉染BHK－21細胞24、48、72和96h后，收集細胞提取細胞RNA，RT－PCR合成cDNA，Realtime PCR檢測樣品中的EGFP和β－actin轉錄水平。結果顯示：JEV復制子轉錄GFP的RNA量隨著轉染時間的延長呈逐漸增長趨勢，EGFPmRNA轉錄量在不同時間相對于陰性對照分別上升0.56倍（P＜0.05）、1.81倍（P＜0.01）、2.06倍（P＜0.01）和3.86倍（P＜0.01），而陰性對照組pAC－exJEV－EGFP中RNA的轉錄量幾乎沒有變化（圖5）。該試驗進一步說明復制子載體pAC－JEV具有表達外源基因的能力。

2.6 基于JEV復制子pAC－JEV的外源基因（GP5和HA）表達檢測

為了驗證JEV復制子表達外源基因的能力，攜帶豬繁殖與呼吸綜合征病毒的GP5基因載體pACJEV－GP5和豬流感病毒HA基因載體pAC－JEVHA分別轉染BHK－21細胞，設定轉染pAC－JEV質粒樣品為陽性對照，設定轉染pAC－JEV－△NS5、pAC－JEV－△NS5－HA、pAC－JEV－△NS5－GP5 質粒樣品作為每一組的陰性對照。分別利用小鼠抗GP5和HA抗體進行檢測，小鼠抗JEV－NS3抗體作為JEV復制子的復制能力指示，β－actin作為蛋白質樣品上樣量對照。結果表明：GP5和HA都能在BHK－21細胞內表達，JEV復制子也能進行自主復制（圖6）。該試驗證明復制子載體pAC－JEV可以作為新型疫苗載體工具，開展多價疫苗的研究。

圖2 間接免疫熒光檢測JEV復制子載體非結構蛋白的表達（40×）Fig.2 Identification of the nonstructural protein expressed by subgenomic replicon vector pAC－JEV by indirect immunofluorescence assay（40×）

圖3 Western blotting檢測非結構蛋白NS3表達量Fig.3 Identification of expression level of the nonstructural protein by Western blotting

圖4 復制子pAC－JEV－EGFP在BHK－21細胞的表達（40×）Fig.4 Expression of the EGFP protein by JEV subgenomic replicon vector pAC－JEV－EGFPin BHK－21cells at various times after transfection（40×）

圖5 Real－time PCR檢測復制子在細胞內RNA量的變化Fig.5 Detecting changes in amount of replicon RNA in cells by Real－time PCR

圖6 攜帶外源基因GP5和HAJEV復制子在BHK－21細胞中的表達Fig.6 GP5and HA were expressed in BHK－21cells by JEV replicon vector

3 討 論

病毒復制子作為能自主復制的病毒亞基因組，是研究病毒復制機制及研發新型核酸疫苗的理想工具。目前病毒復制子存在兩種形式：DNA型復制子和RNA型復制子。目前已經構建成功的多個黃病毒都 是 RNA 復 制 子，如 WNV［7］、YFV［8］、Kunjing［9］、JEV［10－11］，雖然 RNA 復制子能成功進行 體外復制，但是它具有操作繁瑣、不穩定等缺點，但是仍有 部 分 構 建 的 復 制 子 應 用 到 疫 苗 研 究［12－15］。DNA復制子采用CMV啟動子和BGH poly（A）尾巴作為轉錄元件，無需進行體外轉錄、可直接轉染細胞進行表達，并且能作為DNA疫苗直接進行免疫動物，在疫苗研究方面具有良好的應用前景。J.Li等將病毒復制子成功應用到甲病毒快速檢測中［16］，這為病毒復制子應用拓展了新的思路。

JEV病毒為單股正鏈RNA病毒，其復制特點為非結構蛋白（組裝成復制相關酶）可以完成病毒亞基因組的復制［6］，因此本研究利用該特點構建能自主復制的JEV復制子。本研究中作者以JEV弱毒株SA14－14－2感染性克隆為基礎，構建了JEV的DNA型復制子表達載體，選用CMV為啟動子、BGH poly（A）為終止子以保證復制子亞基因組的轉錄起始和終止，亞基因組中去除結構蛋白基因prM和E，避免病毒粒子的包裝，降低生物安全風險。由于有文獻報道結構蛋白C的完整性會對病毒的復制產生一定的影響［17］，因此本研究構建JEV復制子保留了結構蛋白C全基因序列，并在C基因序列的后面添加口蹄疫病毒的2A蛋白基因序列（FMDV－2A），其作用是利于細胞內的蛋白激酶將有效地分開結構蛋白C和后面多克隆位點插入的外源蛋白質［18］。本研究的復制子還保留E蛋白基因羧基端66個堿基，這段序列的存在保證了JEV NS1蛋白的正確剪切和加工［10］，同時也有利于病毒復制酶的正確切割和組合。為使JEV復制子亞基因組的3′端呈天然病毒RNA狀態，在JEV 3′UTR后端添加丁肝病毒核酶（HDVRz）識別序列［19］，保證JEV復制子RNA的3′UTR的正確性，有利于相關酶的識別，從而保證復制子亞基因組的復制。

在本研究中，為了驗證該復制子載體自主復制能力，利用NS3蛋白作為指示，間接免疫熒光和Western blotting檢測，轉染后24～96h，NS3表達逐漸增加。因為NS5蛋白是JEV關鍵的復制酶［20］，將其缺失后病毒無法進行自主復制，NS5蛋白基因缺失組（pAC－JEV－△NS5）無法檢測到 NS3的表達。同時本研究也利用Real－time PCR檢測了JEV復制子的NS3mRNA轉錄情況，結果也說明隨著轉染時間延長，復制子組NS3的mRNA轉錄水平逐漸增加（數據沒有顯示）。以上結果說明JEV復制子pAC－JEV具有自主復制能力。

JEV復制子具有持續表達外源蛋白質EGFP能力，并可以一直持續到8d以后（圖4），國內外學者有相似的研究結果［10－11］，但是本研究所構建的復制子為DNA型復制子［CMV為啟動子、BGH poly（A）為終止子］，具有來源簡單（質粒來自大腸桿菌）、操作方便（不需要體外轉錄和RNA的純化），表達外源蛋白質穩定，GP5和HA等其他病毒蛋白質也能表達（圖6）。該特點將有利于研究開發多聯疫苗，也為研究JEV復制機制提供新的工具。

4 結 論

基于JEV的SA14－14－2毒株成功構建DNA型復制子載體，各種不同方法證明該復制子pAC－JEV具有自主復制能力，在該復制子中插入外源基因GFP、GP5、HA，都能在細胞中表達，并且表達持續時間可達到8d以上，證明該復制子具有較強表達外源蛋白質能力。本研究構建的復制子將為研究JEV各病毒基因和蛋白質功能及復制子多價疫苗研究奠定了基礎和提供新的工具。

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