微囊藻毒素對凡納濱對蝦免疫相關酶活力的影響

陳妍妍，李長玲，黃翔鵠

（廣東海洋大學水產學院，廣東 湛江 524088）

微囊藻毒素對凡納濱對蝦免疫相關酶活力的影響

陳妍妍，李長玲，黃翔鵠

（廣東海洋大學水產學院，廣東 湛江 524088）

通過毒性注射實驗，探究微囊藻毒素（MC-LR）對凡納濱對蝦（Litopenaeus Vannamei）肝臟免疫相關酶活力的影響。結果表明，注射MC-LR后，凡納濱對蝦肝胰臟組織的超氧化歧化酶、谷胱甘肽過氧化酶、過氧化物酶、酸性磷酸酶、堿性磷酸酶和溶菌酶的酶活力呈先增大后減小的變化趨勢。超氧化歧化酶、谷胱甘肽過氧化酶和過氧化物酶活力在對蝦注射MC-LR 4 h后達到峰值，比對照組分別增加了15.62%、18.76%和32.86%，隨后酶活力逐漸減??；而酸性磷酸酶和堿性磷酸酶酶活力在對蝦注射MC-LR 2 h后即顯著增加，比對照組分別增加了25.02%和37.99%，隨后酶活力逐漸減小；溶菌酶在對蝦注射MC-LR后8 h達到最大值，比對照組增加了33.57%，隨后酶活力逐漸減小。MC-LR能顯著影響凡納濱對蝦的免疫相關酶活力（P < 0.05），引起凡納濱對蝦的應激反應和抑制它們的免疫相關酶活力。

微囊藻毒素（MC-LR）；凡納濱對蝦；免疫酶

藍藻水華在蝦池中頻頻發生已成為當前對蝦養殖面臨的突出問題。藍藻水華大量消耗水中的氧氣，釋放羥胺、硫化物和有毒氣體[1]，并產生多種藍藻毒素（cyanotoxins），微囊藻毒素（microcystins, MCs）為其中最為常見和毒性較大的肝毒素之一[2]。有資料顯示，在珠江三角洲的蝦池，以銅綠微囊藻為優勢種的養殖水體可致使對蝦發病[3]。一定濃度顫藻能顯著降低凡納濱對蝦幼蝦的存活率[4]。Gon?alves-soares等[5]報道，凡納濱對蝦經MCs注射處理后，體內過氧化氫酶和谷胱甘肽S-轉移酶活力和相應的基因表達量均出現了上升的趨勢，以抵抗由MCs 誘導的氧化應激作用。另外，MC-LR也能影響凡納濱對蝦抗菌肽基因的表達，對免疫功能造成損傷[6]。目前，關于MCs對凡納濱對蝦免疫酶活力影響的報道還較少。

肝胰臟作為甲殼動物重要的免疫器官，是MCs侵害的主要器官之一，它的功能正常發揮與機體免疫功能息息相關[7-8]。本研究通過往凡納濱對蝦注射微囊藻毒素(WC-LR)，研究其對凡納濱對蝦肝胰臟的超氧化歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化酶(GSH-PX)、過氧化物酶(POD)、酸性磷酸酶(ACP)、堿性磷酸酶(AKP)和溶菌酶(LZM)酶活力的影響，以期從免疫酶活力的變化來探討WC-LR對凡納濱對蝦的毒性作用，為對蝦健康養殖提供一定的參考依據。

1　材料與方法

1.1實驗材料

凡納濱對蝦幼蝦購于粵海飼料集團東海島良種基地，在廣東海洋大學東海島海洋生物研究基地室外對蝦養殖池暫養，一個月后隨機挑選規格相似、健康有活力的對蝦作為實驗對象。

微囊藻毒素標準品（MC-LR）購于臺灣Express (Express Technology Co.Ltd)公司，純度≥95%。毒性實驗前將標準品充分溶解于磷酸鹽緩沖液(PBS)。

1.2實驗方法

1.2.1注射劑量 MC-LR 的注射劑量參考GON?ALVES-SOARES等[5]和李智等[6]的實驗，預實驗測定凡納濱對蝦注射劑量為每kg體質量50 μg MC-LR時，72 h的死亡率為0；而注射劑量為每kg體質量200 μg MC-LR時，72 h的死亡率為100%。故將MC-LR注射劑量設置為每kg體質量100 μg MC-LR，對照組注射等體積的PBS緩沖液。在對蝦腹部第二對游泳足中央的血竇處進行注射。

1.2.2實驗方法本實驗在室內進行，采用300 L的玻璃鋼桶進行毒性脅迫實驗，海水經沙濾和消毒處理，以確保沒有雜質和其他微藻影響實驗對象。實驗期間連續充氣，水溫29±2 ℃。

在正式實驗前，實驗用蝦在室內暫養7 d，每天定時投喂人工飼料2次及更新一部分水體。然后挑選體質量為5.1±0.4 g對蝦作為試驗用蝦，設置1處理組（注射MC-LR）和1個對照組(注射等體積PBS 溶液) ，每組3個平行，每個平行30尾對蝦。

1.2.3采集樣品于注射時間0 h、2 h、4 h、8 h、16 h、24 h、48 h和72 h，分別從各個實驗桶內隨機挑選3尾對蝦，迅速取出肝胰臟放進1.8 mL的凍存管，置于液氮罐中保存，進行酶活力檢測。

1.2.4酶活力檢測準確稱取肝胰臟質量，按質量(g) ∶體積(mL) = 1∶9的比例加入質量分數為0.86%冷生理鹽水，在冰水浴中勻漿 1 min，以3 500 r/min 離心 10 min，制備成質量濃度為0.1 g/mL的組織勻漿，以測定肝胰臟組織勻漿中超氧化歧化酶、谷胱甘肽過氧化酶、過氧化物酶、酸性磷酸酶、堿性磷酸酶和溶菌酶的酶活力，測定方法采用南京建成生物工程研究所相應的檢測試劑盒。

1.3數據統計

采用 SPSS19.0 軟件進行單因素方差分析(oneway ANOVA) 和t 檢驗。使用OriginPro 8.5 進行圖表繪制。

2　結果與分析

2.1WC-LR對凡納濱對蝦超氧化歧化酶活力的影響

WC-LR對凡納濱對蝦超氧化歧化酶活力的影響如圖1所示。WC-LR對對蝦超氧化歧化酶活力有顯著性影響，對蝦注射MC-LR后4 h內，超氧化物歧化酶呈現上升的趨勢，并達到最大值，為123.08 U/mg，比對照組增加了15.62% (F = 24.01, P <0.01)。4 h后，處理組的超氧化歧化酶活性逐步降低，至72 h時達最低值，差異具統計學意義(F = 115.08, P <0.01)。

圖1　MC-LR對凡納濱對蝦超氧化歧化酶活力的影響Fig. 1　Effects of MC-LR on activity of superoxide dismutase of L. vannamei

2.2WC-LR對凡納濱對蝦谷胱甘肽過氧化酶活力的影響

WC-LR對凡納濱對蝦谷胱甘肽過氧化酶活力的影響如圖2所示。MC-LR對對蝦谷胱甘肽過氧化酶活力有明顯的影響。對蝦注射MC-LR后4 h內，谷胱甘肽過氧化酶活力隨著時間延長而逐漸增大，在4 h 達到最大值，為59.62 U/mg，比對照組升高18.76% (F = 16.11, P <0.01)。隨后，處理組的谷胱甘肽過氧化酶活力逐漸下降至最低值，低于對照組，差異具統計學意義(F = 45.37, P <0.01)。

圖2　MC-LR對凡納濱對蝦谷胱甘肽過氧化酶活力的影響Fig. 2　Effects of MC-LR on activity of glutathione peroxidase of L. vannamei

2.3WC-LR對凡納濱對蝦過氧化物酶活力的影響

WC-LR對凡納濱對蝦過氧化物酶活力的影響如圖3所示。WC-LR對對蝦過氧化物酶活力有顯著影響。對蝦注射MC-LR后4 h內，過氧化物酶活力隨著時間延長呈現上升趨勢。在4 h 時，對蝦過氧化物酶酶活力最大，達2.99 U/mg，比對照組增加了32.86% (F = 27.65 , P <0.01)。隨后，處理組的過氧化物酶活力逐漸下降至最低值，低于對照組，差異具統計學意義(F = 92.54 , P <0.01)。

圖3　MC-LR對凡納濱對蝦過氧化物酶活力的影響Fig. 3　Effects of MC-LR on activity of peroxidase of L. vannamei

2.4WC-LR對凡納濱對蝦酸性磷酸酶活力的影響

WC-LR對凡納濱對蝦酸性磷酸酶活力的影響如圖4所示。WC-LR對對蝦酸性磷酸酶活力有顯著影響，呈現先增大后減小的變化趨勢。對蝦注射MC-LR 2 h后，對蝦酸性磷酸酶活力最大，達157.90 U/mg，比對照組增加了25.02% (F = 36.94, P <0.01)。隨后處理組的酸性磷酸酶活力逐漸下降至最低值，低于對照組，差異具統計學意義(F = 136.03, P <0.01)。

圖4　MC-LR對凡納濱對蝦酸性磷酸酶活力的影響Fig. 4　Effects of MC-LR on activity of acid phosphatase of L. vannamei

2.5WC-LR對凡納濱對蝦堿性磷酸酶活力的影響

WC-LR對凡納濱對蝦堿性磷酸酶活力的影響如圖5所示。MC-LR對對蝦堿性磷酸酶活力有明顯的影響。堿性磷酸酶活力在對蝦注射WC-LR后2 h達最高值，為181.76 U/mg，比對照組水平增加37.99% (F = 68.26, P <0.01)。在2 h后呈持續下降趨勢，在72 h時達最低值，處理組的堿性磷酸酶活性僅為對照組的68.68% ，差異具統計學意義(F = 74.80 , P <0.01)。

圖5　MC-LR對凡納濱對蝦堿性磷酸酶活力的影響Fig. 5　級Effects of MC-LR on activity of alkaline phosphatase of L. vannamei

2.6WC-LR對凡納濱對蝦溶菌酶活力的影響

WC-LR對凡納濱對蝦溶菌酶活力的影響如圖6所示。WC-LR對對蝦溶菌酶活力有顯著影響。對蝦注射WC-LR后0～8 h間，溶菌酶活力呈現上升趨勢。對蝦溶菌酶活力在8 h達到峰值，達28.80 U/mg，比對照組增加了33.57% (F = 18.38 , P <0.01)。隨后，處理組溶菌酶活力逐漸下降至最低值，低于對照組，差異具統計學意義(F = 13.5,P <0.01)。

圖6　MC-LR對凡納濱對蝦溶菌酶活力的影響Fig. 6　Effects of MC-LR on activity of lysozyme of L. vannamei

3　討論

3.1WC-LR對凡納濱對蝦超氧化歧化酶、谷胱甘肽過氧化酶和過氧化物酶酶活力的影響

超氧化歧化酶、谷胱甘肽過氧化酶和過氧化物都是機體內的抗氧化酶，在清除活性氧（reactive oxygen specias, ROS），防止生物分子損傷方面發揮重要的生理作用[9]。由于各種外界因素和細胞內部因素刺激而導致體內活性氧增多或機體消除活性氧能力下降，機體就會出現氧化應激（oxygen stress）[10]。有研究表明，MC能致使大鼠肝細胞的活性氧水平上升，并具有時間和劑量依賴性[11]。在體內急性毒性實驗中，Moreno等[12]以每千克100和150 μg MC的劑量經腹腔注射處理大鼠，在8h后，MC能顯著性抑制超氧化歧化酶的酶活性。Prieto等[13]研究表明，尼羅羅非魚(Oreochromis niloticus)經口服銅綠微囊藻制成的飼料微丸，谷胱甘肽過氧化酶活力會受微囊藻毒素（MC-LR）抑制，活力下降。樂亞玲等[14]發現克氏原螯蝦（Procambarus clarkii）血清中的過氧化物酶活性在高濃度銅綠微囊藻中暴露1 d 后顯著增加。在本實驗中，在對蝦經MC-LR處理4 h后，超氧化歧化酶、谷胱甘肽過氧化酶和過氧化物酶活力均分別顯著高于其他處理組( P <0.05) ，且達到最大值，之后隨著時間延長，超氧化歧化酶、谷胱甘肽過氧化酶和過氧化物酶活力呈現降低的變化趨勢。推測產生該結果的原因是，超氧化歧化酶、谷胱甘肽過氧化酶和過氧化物酶活性的增強可能是由于MC-LR誘導的活性氧的增加，機體提高超氧化歧化酶、谷胱甘肽過氧化酶和過氧化物酶活力用于清除體內過多的活性氧，以維持內環境中自由基的動態平衡；而它們的酶活性降低則可能是由于MC-LR通過細胞膜進入細胞后對細胞或酶結構造成氧化損傷引起的。由此，筆者認為MC-LR能引起凡納濱對蝦的應激反應，隨著時間延長，毒素能抑制抗氧化酶活力從而削弱機體抗氧化酶清除活性氧的能力。

3.2WC-LR對凡納濱對蝦酸性磷酸酶和堿性磷酸酶酶活力的影響

酸性磷酸酶和堿性磷酸酶不僅是甲殼動物體內重要的解毒酶類，而且作為溶酶體酶的重要組成部分，在機體免疫系統中發揮積極作用[15]。張雙玲等[16]認為酸性磷酸酶和堿性磷酸酶活性隨MC毒素濃度和作用時間的變化而發生相應變化，可以作為MC 脅迫的生物標志物。Molina等[17]研究發現，羅非魚(Oreochromis sp.)暴露于一定濃度銅綠微囊藻21 d后，肝臟酸性磷酸酶和堿性磷酸酶酶活力顯著高于對照組。曹平等[4]研究表明，低濃度的顫藻可誘導凡納濱對蝦堿性磷酸酶活性增加，而高濃度顫藻能抑制堿性磷酸酶活性。本實驗結果顯示：WC-LR對對蝦酸性磷酸酶和堿性磷酸酶酶活力有顯著影響(P <0.05)，對蝦的酸性磷酸酶和堿性磷酸酶酶活力呈先升高后下降的趨勢，在2 h處達到最高值，隨后下降并顯著性低于對照組。說明對蝦受到MC-LR的脅迫后，可誘導酸性磷酸酶和堿性磷酸酶活力快速增加，從而增強機體解毒能力，但隨后酸性磷酸酶和堿性磷酸酶活力持續下降，可能與MC-LR 誘導的氧化損傷有關[11-12,18]。因此，說明MC-LR對對蝦有致毒作用，能促使對蝦提高酸性磷酸酶和堿性磷酸酶酶活力來抵御這種毒性作用。

3.3WC-LR對凡納濱對蝦溶菌酶活力的影響

溶菌酶是非特異性免疫系統中的重要成分，在甲殼動物體內形成水解酶體系，能有效地清除體內的異物[19]。Juhel等[20]用有銅綠微囊藻喂養斑馬貽貝（Dreissena polymorpha）3周后，溶菌酶活力顯著高于對照組，且與 MC 暴露有時間-效應關系。有研究表明，鯉魚(Cyprinus carpio L.)在MC-LR脅迫下，溶菌酶活力顯著低于對照組[21]。李智等[6]研究發現，經MC-LR 注射后的凡納濱對蝦的抗菌肽基因的表達量均低于對照組，表明MC-LR能影響其抗菌肽在抵御外來細菌入侵時的抗菌能力。本實驗中，隨著MC-LR處理的時間延長，對蝦的溶菌酶活力呈先升高后下降的趨勢，并在8 h處達到最高值，隨后下降。表明對蝦在經WC-LR注射后，溶菌酶活力受到刺激產生應激反應，活力呈上升趨勢，這可能是由于MC-LR影響了對蝦體內溶酶體細胞膜的完整性，導致不同水解酶釋放出來，用于抵御MC-LR對機體的侵害，但其中參與的水解酶種類和作用的機制比較復雜，仍需更多的研究來探討MC-LR對體液免疫的影響[20]。

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（責任編輯：陳莊）

Effects of Microcystin on Activities of Immune Enzymes in the White Shrimp Litopenaeus Vannamei

CHEN Yan-yan，LI Chang-ling，HUANG Xiang-hu
(Fisheries College of Guangdong Ocean University，Zhanjiang 524088，China)

The study was conducted to investigate the effects of microcystins（MC-LR）on the activity of immune enzymes in the hepatopancreas of white shrimp Litopenaeus Vannamei by toxicity experiment. The results showed that the activity of superoxide dismutase, glutathione peroxidase, peroxidase，acid phosphatase，alkaline phosphatase and lysozyme were significantly affected by MC-LR with the increasing of time（P < 0.05）. Activities of these emzymes inereased in the early period of the experiment and decreased in the later period. The activities of superoxide dismutase，glutathione peroxidase and peroxidase increased 15.62%，18.76% and 32.86% at 4 h, reapectively. The activities of acid phosphatase and alkaline phosphatase increased 25.02% and 37.99% at 2 h，reapectively. The activities of lysozyme increased 33.57% at 8 h. It is concluded that MC-LR can not only induce stress response, but also suppress immune enzymes activities of L. Vannamei.

microcystin（MC-LR）；Litopenaeus Vannamei；immune enzymes

S945

A

1673-9159（2015）06-0035-06

10.3969/j.issn.1673-9159.2015.06.007

2015-11-03

公益性行業（農業）科研專項（201203083）；廣東省專業鎮中小微企業服務平臺建設項目（2012B040500025）；廣東省海洋漁業科技推廣專項（A201308B10）

陳妍妍（1989—），女，碩士研究生，研究方向為水域生態。

李長玲, 女, 教授，研究方向為水域生態。E-mail: ybcl901@126.com