中草藥復合益生菌制劑對凡納濱對蝦生長、抗病力及水質的影響

湯菊芬，黃　瑜，蔡　佳，魯義善，吳灶和，簡紀常

（1. 廣東海洋大學水產學院，廣東　湛江 524088；2. 廣東省水產經濟動物病原生物學及流行病學重點實驗室，廣東　湛江　524088）

中草藥復合益生菌制劑對凡納濱對蝦生長、抗病力及水質的影響

湯菊芬1,2，黃瑜1,2，蔡佳1,2，魯義善1,2，吳灶和2，簡紀常1,2

（1. 廣東海洋大學水產學院，廣東湛江 524088；2. 廣東省水產經濟動物病原生物學及流行病學重點實驗室，廣東湛江524088）

將枯草芽孢桿菌、納豆芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌等比例混合，制成芽孢桿菌制劑；將芽孢桿菌制劑與糞腸球菌、嗜酸乳桿菌等比例混合制成復合益生菌制劑；將分別用3種芽孢桿菌發酵的中草藥等比例混合制成中草藥芽孢桿菌制劑；將分別用5種益生菌發酵的中草藥等比例混合，制成中草藥復合益生菌制劑。在飼料中分別添加4種益生菌制劑（活菌為2×107cfu/g），研究 4 種制劑對凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei）生長、抗病力及水質的影響。結果表明：1）4種益生菌制劑均可提高凡納濱對蝦的成活率、增重率和飼料利用率（P < 0.05），中草藥益生菌制劑組的促生長效果優于益生菌制劑組，以中草藥復合益生菌制劑組促生長效果為最佳（P < 0.05）；2）4種益生菌制劑均可維持對蝦養殖水體 pH 值、氨態氮和亞硝酸鹽含量的穩定（P < 0.05），中草藥益生菌制劑對水質的改良效果優于益生菌制劑（P < 0.05）；3）用 1×108cfu/mL 的哈維氏弧菌（Vibro harveyi）菌液浴浸泡凡納濱對蝦 10 d，凡納濱對蝦的累計死亡率由大到小依次為中草藥復合益生菌制劑組（31.11%）、復合益生菌制劑組（35.56%）、中草藥芽孢桿菌制劑組（37.78%）、芽孢桿菌制劑組（44.44%）、對照組（93.33%）。在飼料中添加一定比例的中草藥復合益生菌制劑可提高凡納濱對蝦的生長指標、改善養殖水體環境、提高對蝦的抗病力。

凡納濱對蝦；飼料添加劑；益生菌制劑；中草藥；復合制劑；生長；水質；抗病力

近年來，隨著對蝦集約化養殖的迅猛發展，水環境惡化，病害頻發，抗生素及其他藥物的使用已產生細菌抗藥性及藥物殘留等問題，嚴重影響了對蝦產業的健康持續發展[1-2]。為此，尋找無公害藥物替代品成為研究熱點。中草藥和益生菌因具有促進養殖動物生長、增強機體免疫功能及抗病力等功效，廣泛應用于水產養殖業[3-4]。研究表明，中草藥和益生菌共同使用具有協同增效作用，中草藥可促進益生菌增殖，益生菌可促進生物體對中草藥的吸收和利用[5]。有關中草藥和益生菌聯合使用在畜禽上的研究較多，在水產方面的研究僅見在凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei）[6-9]、羅非魚（Oreochromis niloticus）[10]和建鯉（Cyprinus carpio）[11]方面的報道，但這些研究均為同時在飼料中添加益生菌和中草藥，而用益生菌發酵中草藥，制備中草藥復合益生菌制劑，研究添加該制劑的對蝦飼料養殖效果方面尚未見報道。本研究在凡納濱對蝦飼料中添加一定比例的中草藥復合益生菌制劑，研究中草藥復合益生菌制劑對凡納濱對蝦生長、抗病力及養殖水質的影響，為中草藥復合益生菌制劑在對蝦養殖業中的推廣應用提供理論依據。

1　材料與方法

1.1材料

試驗用凡納濱對蝦，同批次，同齡，同規格，體質量（5.82±0.4）g，由湛江市東海島民安鎮大熟村林老板對蝦養殖池塘提供，挑選健康、規格均一的對蝦暫養7 d后用于試驗，暫養條件：溫度（28.5 ±2）℃，鹽度為5，過濾、消毒海水。

復方中草藥制劑由金銀花、板藍根、杜仲、五味子、黃芪、山楂、生姜、金銀花、連翹、柴胡、甘草組成，粉碎，過孔徑180 μm篩，按一定比例混勻。

菌株納豆芽孢桿菌（Bacillus natto）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、地衣芽孢桿菌（Baclicus lincheniformis）、嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）、糞腸球菌（Enterococcus faecalis）由廣東綠百多生物科技有限公司提供。

基礎飼料，某品牌的凡納濱對蝦 2 號料，購于東海島東簡鎮的某飼料經銷店，營養指標（質量分數）：水分10.53%，粗蛋白42.08%，粗脂肪9.33%，粗灰分0.95%，粗纖維2.66%。

1.24種益生菌制劑的制備

1.2.1芽孢桿菌制劑及復合益生菌制劑的制備菌種活化：取納豆芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌菌種，分別以體積分數1% 接種于營養肉湯中，于搖床中，在37 ℃、200 r/min的條件下培養24 h，再二次活化12 h后備用。嗜酸乳桿菌、糞腸球菌分別接入乳酸細菌（MRS）液體培養基中，于37 ℃、厭氧條件下培養48 h，再二次活化24 h后備用。

芽孢桿菌制劑由上述3株芽孢桿菌等比例組成，復合益生菌制劑是由芽孢桿菌制劑、糞腸球菌和嗜酸乳桿菌等比例混合而成，于4 ℃冰箱保存備用。

1.2.2中草藥芽孢桿菌制劑及中草藥復合益生菌制劑的制備參照郭文婷等[12]方法，將復方中草藥制成生藥質量濃度為1 g/mL 的提取液，再按表 1比例，在 5 種益生菌的培養基中分別加入中草藥提取液，然后再分別接種體積分數1%的5 種已活化益生菌，制得 5 種中草藥益生菌。中草藥芽孢桿菌制劑由 3 種中草藥芽孢桿菌等比例混合而成，中草藥復合益生菌制劑由5種中草藥益生菌等比例混合而成。

表1　5種益生菌制劑培養方法Table 1　Cultivation method of five probiotics

1.3試驗飼料制備

試驗飼料按表 2 制備。

1.4試驗設計

將凡納濱對蝦隨機分成5個處理，每個處理3個重復組。標記為A、B、C、D、E組（表2），按表2所示分別飼喂基礎飼料和試驗飼料。

1.5飼養管理方法

養殖試驗在廣東海洋大學東海島高新科技園室內養殖車間的 15 只裝水0.5 m3的玻璃鋼桶中進行，周期為 30 d。每個玻璃鋼桶放養對蝦30 尾，依照1.4 的方案按體質量的8% ～ 10%投喂相應飼料，投飼時間分別為 6:00、10:00、19:00 和 23:00，早晚的投喂量占日投喂量的 60%～70%。每周根據對蝦的生長狀況調節投飼量。試驗期間不間斷充氣，不換水，每天清理糞便。水溫為 (28.5±2) ℃。

表2　試驗飼料Table 2　Preparation of experiment feed

1.6生長及水質指標測定

檢測實驗開始時養殖水體的pH值、氨態氮和亞硝酸鹽含量，然后每3 d在17：00取水樣測定水體的pH值、氨態氮和亞硝酸鹽含量。養殖試驗結束時，停食24 h，各組對蝦稱質量，計數。

增重率 =（終末體質量 - 初始體質量 / 初始體質量）×100 %，

成活率 = 終末對蝦數 / 初始對蝦數×100 %，

餌料系數 = 攝食量 / (終末體質量 + 死亡個體質量 - 初始體質量)。

氨態氮用納氏比色法測定，亞硝酸鹽用萘乙二胺分光光度法檢測，pH值用玻璃電極法檢測。

1.7攻毒試驗

參照朱學芝等[13]方法，在養殖試驗結束后，每組隨機抽取對蝦45 尾，用含哈維氏弧菌（Vibrio harveyi）的水浸泡凡納濱對蝦，水體中的哈維氏弧菌維持在1×108cfu/mL，觀察 10 d內的對蝦死亡情況，統計死亡率。試驗期間停飼。

1.8數據處理

采用Excel 和SPSS11.5 軟件對數據進行統計分析，先對數據作單因素方差分析（ANOVA），對有顯著差異者作Duncan’s 多重比較，所有數值用平均值±標準誤表示。

2　結 果

2.1中草藥益生菌制劑對凡納濱對蝦生長性能指標的影響

中草藥益生菌制劑對凡納濱對蝦生長性能指標的影響見表3。B、C、D、E 組凡納濱對蝦的成活率和增重率均高于A組，餌料系數低于A組，差異有統計學意義（P < 0.05），且C組和E組對凡納濱對蝦生長性能指標的影響效果分別優于B組和D組，說明飼料中添加益生菌制劑、中草藥益生菌制劑均可以顯著促進凡納濱對蝦生長，中草藥益生菌制劑的促生長效果優于益生菌制劑，以添加中草藥復合益生菌制劑的促生長效果為最佳。

2.2中草藥益生菌制劑對養殖水體 pH值的影響

圖1可見，對照組和實驗組pH值均從9 d開始呈下降趨勢。尤其是在養殖后期，由于積累有機物的發酵分解，A組pH值的下降較其他組快（P < 0.05），4個實驗組pH變化差異無統計學意義（P > 0.05），說明飼料添加益生菌制劑、中草藥益生菌制劑均可維持水體pH相對穩定，有利于凡納濱對蝦生長。

表3　中草藥益生菌制劑對凡納濱對蝦生長及飼料利用率的影響Table 3　Effects of probiotics combined with Chinese herbal medicine on growth and feed utilization of of Litopenaeus vannamei

圖 1　pH值的變化情況Fig. 1　pH change in experimental water

2.3中草藥益生菌制劑對養殖水體亞硝酸鹽的影響

中草藥益生菌制劑對養殖水體亞硝酸鹽含量的影響見圖2。圖2可見，5組的亞硝酸鹽含量在實驗初期均上升較慢，隨著實驗的進行，對照組亞硝酸鹽含量9 d時開始迅速增加，其他4組均于15 d時方緩慢增加，且4個實驗組亞硝酸鹽含量均低于同期對照組（P < 0.05），但4個實驗組之間亞硝酸鹽含量差異無統計學意義（P > 0.05）。說明在飼料中添加益生菌制劑、中草藥益生菌制劑均可降低養殖水體亞硝酸鹽的含量。

圖 2　亞硝酸的變化情況Fig. 2　Change of nitrite content in experimental water

2.4中草藥益生菌制劑對養殖水體氨態氮的影響

中草藥益生菌制劑對養殖水體氨態氮含量的影響見圖3。圖3可見，實驗初期（前3 d），各組間氨態氮含量差異無統計學意義（P > 0.05），但從6 d時開始，4個實驗組氨態氮含量均低于同期對照組（P < 0.05），中草藥復合益生菌制劑組對養殖水體的氨態氮降解效果優于益生菌制劑組（P < 0.05）。

圖3　氨態氮的變化情況Fig. 3 Ammonia change in experimental water

2.5中草藥益生菌制劑對凡納濱對蝦抗病力的影響

中草藥益生菌制劑對凡納濱對蝦抗病力的影響見圖4。圖4表明，經人工感染哈維氏弧菌后，凡納濱對蝦的累計死亡率E組（31.11%）< D組（35.56%）< C組（37.78%） < B組（44.44%） < 對照組（93.33%），說明在飼料中添加益生菌制劑、中草藥益生菌制劑均可提高凡納濱對蝦抗哈維氏弧菌感染的能力，對蝦抗病力以中草藥復合益生菌制劑組效果最佳。

圖4　中草藥益生菌制劑對凡納濱對蝦抗病力率的影響Fig. 4　Effect of probiotics combined with Chinese herbal medicine on survival rate of Litopenaeus vannamei

3　討 論

3.1中草藥益生菌制劑對凡納濱對蝦生長性能的影響

益生菌可產生維生素、氨基酸、促生長因子、蛋白酶、脂肪酶、纖維素酶等多種酶，促進水產動物的生長[14-15]。李曉英等[16]在飼料中添加復合芽孢桿菌時發現，實驗組中國對蝦（Fenneropenaeus chinensis）的平均生長速度為0.15 g/d，顯著高于對照組（0.12 g/d）；朱學芝等[17]將乳酸桿菌（Lactobacillus sporogenes）、地衣芽孢桿菌+枯草芽孢桿菌（等比例）、復合菌蝦樂333添加于飼料中或投入養殖水體中，結果發現，三者均可促進凡納濱對蝦的生長，降低飼料系數。胡毅等[18]研究飼料中添加單一益生菌和復合益生菌，結果表明，復合益生菌飼喂組凡納濱對蝦的特定生長率高于對照組 (P < 0.05)，而單一益生菌飼喂組與對照組差異無統計學意義(P > 0.05)。于明超等[7]研究表明，飼料中添加中草藥和芽孢桿菌促進了凡納濱對蝦的生長，且共同添加的效果優于單獨添加。本研究結果與上述研究結果相一致，證明飼料中添加芽孢桿菌制劑、中草藥芽孢桿菌制劑、復合益生菌制劑、中草藥復合益生菌制劑均可促進凡納濱對蝦的生長（P < 0.05），中草藥益生菌制劑組的促生長效果優于益生菌制劑組，以中草藥復合益生菌制劑的促生長效果最佳。這可能是因為中草藥和益生菌具有協同增效作用。一方面，中草藥富含多種營養物和一些未知的誘食因子，可以增強養殖動物的食欲，促進水產動物機體代謝和消化酶的分泌，提高營養物質利用率，從而加速養殖動物生長發育，降低飼料系數[19]；另一方面，益生菌制劑中的芽孢桿菌和乳酸桿菌可產生多種消化酶類[11]，可提高動物消化道內消化酶的生物活性，促使動物機體更好地消化和吸收胃腸道中的營養物質，提高飼料利用率。此外，乳酸桿菌還可分解轉化飼料中一些機體難以吸收的有機物質，將一些糖類發酵成乳酸，降低動物腸道中的pH 值而形成酸性環境，有利于動物機體對鈣、鐵等礦物質和維生素的吸收和利用，從而促進凡納濱對蝦的生長。

此外，本研究中對照組和試驗組的對蝦增重率均高于文獻[7, 17-18]結果，可能與本研究的凡納濱對蝦正好處于生長速度較快的中后期階段，以及與對蝦飼料不同有關。

3.2中草藥益生菌制劑對水質因子的影響

在集約化水產養殖中，殘餌及水產動物的排泄物等是水體污染的主要來源[20]。益生菌制劑可降解水體中有機質，一定程度上調節水質，由于各細菌種屬能量代謝的途徑和方式也不同，因此對環境中不同種類有機質的降解能力也存在一定差異[21]。朱學芝等[17]在飼料中添加乳酸桿菌、復合芽孢桿菌、復合菌蝦樂等益生菌制劑，實驗組水體中的 pH值、氨態氮和亞硝酸鹽含量均低于對照組；而湯保貴等[10]研究表明，飼料中添加益生菌制劑和中草藥聯合制劑可明顯降低羅非魚（Oreochro is niloticus）養殖水體中的亞硝酸鹽，但對氨氮無降低作用。本研究表明，飼料中添加益生菌制劑、中草藥益生菌制劑均可穩定養殖水體的氨態氮、亞硝酸鹽和pH 值，與朱學芝等[17]的結果一致，而與湯保貴等[10]的結果略有差異。這可能是因為未定植對蝦腸道而隨糞便排入水體的益生菌，以及隨殘餌釋放入水體的益生菌在適宜環境下生長增殖，從而發揮水質調節作用；試驗對象、所用益生菌菌種、中草藥益生菌制劑的制備和使用方法等的不同可能導致與湯保貴等[10]的結果略有差異。

3.3中草藥益生菌制劑對凡納濱對蝦抗病力的影響

益生菌制劑通過分泌抑菌物質與病原菌爭奪營養或附著位點而抑制其生長，改善機體免疫功能等[22]。朱學芝等[13]研究表明，飼料中添加芽孢桿菌可提高凡納濱對蝦血細胞總量以及血清酚氧化酶、堿性磷酸酶和酸性磷酸酶含量（P < 0.05），降低血清谷草轉氨酶和谷丙轉氨酶的含量（P < 0.05），提高對蝦抗溶藻弧菌感染的能力。據胡毅等[18]報道，飼料中添加益生菌可降低凡納濱對蝦腸道及糞便的弧菌數（P < 0.05），提高對蝦血清蛋白濃度、酚氧化酶活力、溶菌酶活力和總抗氧化力。文國樑[6]研究了飼料中添加芽孢桿菌和中草藥制劑對凡納濱對蝦免疫功能的影響，發現芽孢桿菌和中草藥制劑對凡納濱對蝦的免疫指標（血細胞數量、酚氧化酶、活菌酶等) 產生積極影響，并有一定的協同作用。本研究結果與朱學芝[17]、胡毅[18]、文國樑等[6]的研究結果相一致，經人工感染哈維氏弧菌后，4個實驗組對蝦的存活率高于實驗組（P < 0.05），復合益生菌制劑組的存活率高于芽孢桿菌制劑組，中草藥復合益生菌制劑組的抗病效果優于中草藥芽孢桿菌制劑組，以中草藥復合益生菌制劑組對蝦抗病力最強。這可能與中草藥與益生菌產生協同增效作用有關。一方面，中草藥在體外經益生菌發酵、分解后產生了有機酸、生物堿等抑菌物質，這些抑菌物質進入對蝦腸道后可抑制有害致病菌的生長繁殖；中草藥中所含黃酮、皂甙、核苷酸、維生素、葉酸、多糖等活性成分本身就是益生菌的重要生長因子[23]，進入對蝦腸道后，可促進益生菌的增殖并分泌抑菌物質；各種益生菌在腸道中的生長增殖勢必會與腸道中有害病原菌搶奪營養物質和附著位點，從而抑制了病原菌的生長繁殖，增強對蝦的抗病能力。此外，芽孢桿菌在腸道中的生長繁殖，會消耗掉腸道中氧氣，為腸道乳酸桿菌（Lactobacillue）、雙歧桿菌（Bifidobacterium）等厭氧細菌的繁殖創造厭氧環境條件，同時也抑制了好氧病原菌的生長繁殖，這可能是復合益生菌比單一益生菌具有更好抗病效果的原因。復合益生菌制劑組對蝦的存活率高于中草藥芽孢桿菌制劑組，可能與不同細菌在腸道微生物區系中占有的生態位不同有關。

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（責任編輯：劉慶穎）

Effects of a Probiotics Combined with Chinese Herbal Medicine on Growth Performance, Water Quality and Resistance to Diseases for Litopenaeus vannamei

TANG Ju-fen1,2, HUANG Yu1,2, CAI Jia1,2, LU Yi-shan1,2, WU Zao-he2, JIAN Ji-chang1,2
（1. Fisheries College of Guangdong Ocean University, Zhanjiang 524088, China; 2. Guangdong Province Key Laboratory of Pathogen Biology and Epidemiology of Aquatic Economic Animals, Zhanjiang 524088, China）

The effects of a probiotics combined with Chinese Herbal Medicine on growth performance, water quality and resistance to diseases of Litopenaeus vannamei were studied by adding four different probiotics (2×107cfu/g), compound Bacillus (mixed Bacillus subtilis, Bacillus natto and Baclicus lincheniformis with equal parts), Chinese herbal medicine compound Bacillus, compound Probiotics (mixed Enterococcus faecalis, Lactobacillus acidophilus and compound Bacillus with equal parts), Chinese herbal medicine compound probiotics,respectively to the feed. The results indicated that: (1) Four probiotics had significant effects on survival rate, weight-gaining and feed conversion ratio (P<0.05), and Chinese herbal medicine probiotics group on the growth promoting effect is better than that of probiotics group, that of Chinese herbal medicine compound probiotics group to the best (P<0.05). (2) Four probiotics can maintain the stable of pH, ammonia nitrogen and nitrite of aquaculture water (P<0.05), The effects of Chinese herbal medicine probiotics on the improvement of water quality is better than that of probiotics（P<0.05）；(3) After water bath soak Litopenaeus vannamei with containing 1×108cfu/mL of Vibro harveyi for 10 d, the cumulative mortality rate of Litopenaeus vannamei respectively are Chinese herbal medicine compound probiotics (31.11%), compound Brobiotics (35.56%), Chinese herbal medicine compound Bacillus (37.78%), compound Bacillus (44.44%), control group (93.33%). Results showed that by adding a certain proportion of Chinese herbal medicine compound probiotics, the growth index of Litopenaeus vannamei can be enhanced, the quality of aquaculture water and capacity of disease resistance can be improved.

Litopenaeus vannamei; feed additive; probiotics; compound preparation; Chinese Herbal Medicine; growth; disease resistance; aquaculture water quality

S963.73+6

A

1673-9159（2015）06-0047-06

10.3969/j.issn.1673-9159.2015.06.009

2015-06-30

廣東省科技計劃項目（2015A020209181）；湛江市科技計劃項目 (2012A0302）

湯菊芬（1964－），女，碩士，高級工程師，主要從事水產動物營養與免疫研究。E- mail: tjf10002000@163.com

簡紀常，男，教授，主要從事水產動物免疫及疾病控制。E-mail：jianjc@gmail.com