飛機草總黃酮體外抑菌活性與體內抗大腸埃希菌感染效果

鄭錦慶，王小寧，岳　杰，馬　驛，巨向紅，林紅英，陳進軍

（廣東海洋大學農學院，廣東　湛江　524088）

飛機草總黃酮體外抑菌活性與體內抗大腸埃希菌感染效果

鄭錦慶，王小寧，岳杰，馬驛，巨向紅，林紅英，陳進軍

（廣東海洋大學農學院，廣東湛江524088）

提取飛機草（Eupatorium odoratum Linn.）總黃酮，從抑菌圈、最小抑菌濃度（MIC）及最小殺菌濃度（MBC）等方面探討飛機草總黃酮對金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、雞白痢沙門氏菌（Salmonella pullorum）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、大腸埃希菌（Escherichia coli）的體外抑菌活性；經腹腔注射大腸埃希菌感染小鼠后，灌胃給予飛機草總黃酮，觀察供試小鼠腹瀉率，測定小鼠糞便大腸埃希菌數及血清抗體水平（IgM、IgA和IgG），評價飛機草總黃酮的體內抗感染作用。結果表明，金黃色葡萄球菌對飛機草總黃酮最為敏感，其抑菌圈直徑為19.50 mm，MIC為0.015 6 g/mL，MBC為0.031 3 g/mL；160 mg/kg的飛機草總黃酮可降低小鼠腹瀉率和糞便大腸埃希菌數（P < 0.01），提高血清IgA（P < 0.01）和IgG含量（P < 0.05）。飛機草總黃酮具有體內、體外抗菌作用。

飛機草；總黃酮；體外抑菌；體內抗感染

飛機草（Eupatorium odoratum Linn.）別名香澤蘭，為菊科澤蘭屬多年生草本植物，原產中美洲，1934年在我國云南南部發現。飛機草作為外來物種，對自然環境危害嚴重，目前已入侵我國南方大部分地區，是一種具有競爭性的有害物種。迄今從飛機草中分離、鑒定出的化學成分以黃酮類、萜類、揮發油和植物甾醇類為主，其中黃酮類化合物含量尤為豐富，全草總黃酮質量分數達2.07%，無水乙醇浸膏中總黃酮質量分數達12.57%[1]。飛機草具有抑菌、消炎、解毒、促進傷口愈合等功效[2-4]，且其多種藥效證明與其所含黃酮類化合物有關[5]。對飛機草進行獸醫藥效學研究是將其“變害為寶”的有益嘗試。本研究制備飛機草總黃酮，探討其體外抑菌活性及體內抗大腸埃希菌感染效果，為飛機草總黃酮提取物用于畜禽腹瀉控制提供試驗依據。

1　材料與方法

1.1菌種與培養基

金黃色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus）（ATCC 25923）、雞白痢沙門氏菌（Salmonella pullorum）（ATCC14028）、大腸埃希菌（Escherichia coli）（CMCC44752）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）[CMCC(B) 63501]由廣東海洋大學獸醫微生物教研室提供。LB營養肉湯、營養瓊脂及麥康凱培養基購自北京陸橋技術有限責任公司。

1.2動物

昆明種清潔級小鼠，雌雄各半，體質量20 ～ 23 g。

1.3主要儀器與試劑

主要儀器有生化培養箱（LRH-150B，上海博迅實業有限公司醫療設備廠）、醫用凈化工作臺（YJ-875DA，上海博訊實業有限公司醫療設備廠）、旋轉蒸發器（RE-52AA，上海亞榮生化儀器廠）、KQ-500DE型數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）、循環水多用真空泵（SHZ-Ⅱ，河南鞏義市英峪予華儀器廠）、酶標儀（MK3型，美國Thermo公司）等。ELISA試劑盒購自上海泛柯實業有限公司，其他試劑均為分析純。

1.4細菌懸液制備

將菌種接種于營養瓊脂培養基上，37 ℃條件下培養16 h，挑取單個菌落接種至肉湯培養基，37℃條件下培養16 h后，用平板計數法計數，用肉湯稀釋至107～ 109cfu/mL備用。

1.5飛機草總黃酮制備

將采自廣東湛江湖光巖的飛機草陰干，粉碎，過孔徑150 μm篩，于4 ℃條件下保存。參考楊逄建等方法[1]，以總黃酮為提取目標物，取飛機草粉10 g，置于旋轉蒸發儀梨型蒸發器中，加入500 mL體積分數60%乙醇，浸泡24 h后將其置于超聲波清洗器中，以頻率20 kHz提取30 min后將提取液安裝到旋轉蒸發儀上在70℃下減壓蒸發進行提取4 h，同時打開冷凝閥門回收乙醇。提取液冷卻，過濾，得飛機草黃酮化合物提取液。將飛機草總黃酮提取液用10倍體積的石油醚萃取，除去葉綠素，再用乙酸乙酯萃取純化，揮發去乙酸乙酯，得純化的總黃酮浸膏，密封，于4 ℃冰箱內保存備用。經定性檢測[6]，該提取物中黃酮類化合物顯色反應為強陽性，而其他生物活性成分如生物堿等均為陰性。以蘆丁為標準品，利用分光光度法[7]定量測得該提取物含總黃酮質量分數為18.84%。

1.6飛機草總黃酮體外抑菌試驗

抑菌圈測定：采用打孔法測定抑菌圈直徑[8]。

最小抑菌濃度（MIC）測定：采用試管倍比稀釋法，每個菌種3個重復。

最小殺菌濃度（MBC）測定：將上述培養物繼續培養至48 h，接種于普通瓊脂平板上，培養8～12 h后觀察，無細菌生長的最小藥物濃度即為該藥物的最小殺菌濃度（MBC）[9]。

1.7飛機草總黃酮體內抗感染試驗

將90只試驗小鼠分為空白對照組，飛機草總黃酮高、中、低劑量組，自愈組等5個組，每組18只小鼠。高、中、低劑量組（160、40、10 mg/kg）：小鼠腹腔注射約3×108個大腸埃希菌后3 h開始給高、中、低劑量組小鼠灌胃給予不同劑量的飛機草黃酮，每天1次；自愈組小鼠只用大腸埃希菌腹腔注射感染，不作任何處理；空白對照組小鼠用生理鹽水代替飛機草總黃酮和大腸埃希菌懸液。每天觀察糞便，計算腹瀉率，于感染大腸埃希菌后1、4、7 d無菌采集小鼠糞便，對大腸埃希菌計數，并采集小鼠血清，用ELISA法測定血清抗體IgM、IgA、IgG含量。

1.8數據統計分析

數據采用SPSS 17.0軟件中的ANOVA程序進行方差分析，多重比較用LSD法，P < 0.05為顯著水平，結果以平均值±標準差（SD）表示。

2　結果與分析

2.1供試細菌對飛機草總黃酮的藥物敏感性

飛機草總黃酮對4種供試細菌的抑菌圈均大于10 mm，達中度敏感以上。其中對金黃色葡萄球菌的抑菌活性最強，抑菌圈直徑達19.50 mm；對大腸埃希菌的抑菌活性最弱，抑菌圈直徑為11.00 mm，達中度敏感（表1）。

表1　飛機草總黃酮（0.5 g/mL）對4種細菌的抑菌活性Table 1　Bacteriostatic activity of flavonoids ( 0.5 g/mL ) from Eupatorium odoratum against 4 strains of bacteria

2.2飛機草總黃酮對供試細菌的MIC、MBC

飛機草總黃酮對金黃色葡萄球菌的MIC、MBC最低，分別為0.015 6、0.031 3 g/mL，說明飛機草總黃酮對金黃色葡萄球菌具有良好的體外抑菌效果（表2）。

表2　飛機草總黃酮對4種細菌MIC、MBC值Table 2　MIC and MBC of flavonoids from Eupatorium odoratum against four strains of bacteria　　g/mL

2.3飛機草總黃酮對小鼠腹瀉率的影響

由圖1可見，感染大腸埃希菌1 d，除空白對照組，其他各組供試小鼠的腹瀉率均為100%；攻毒2、3、4 d時，高劑量組腹瀉率均為最低，分別為58.33%、25%、8.33%；攻毒5 d后各組腹瀉率為0。可見一定劑量的飛機草總黃酮可有效降低大腸埃希菌感染小鼠的腹瀉率。

2.4飛機草總黃酮對小鼠糞便大腸埃希菌數的影響

由表3可知，攻毒1 d后，各處理組糞便大腸埃希菌數高于對照組，高劑量組低于中、低劑量組及自愈組，差異均有統計學意義（P < 0.01）。攻毒4 d時，各處理組大腸埃希菌數高于對照組，差異有統計學意義（P < 0.05），高劑量組低于中、低劑量組及自愈組，差異有統計學意義（P < 0.01）。攻毒7 d后，高劑量組與對照組差異無統計學意義（P > 0.05），中、低劑量組及自愈組與對照組差異有統計學意義（P < 0.01）。由此可見，飛機草總黃酮對小鼠腸道內大腸埃希菌具有一定的抑菌作用，高劑量總黃酮抑菌效果最佳。

圖1　飛機草總黃酮對小鼠腹瀉率的影響Fig. 1　Effect of flavnoids from Eupatorium odoratum on ratio of diarrhea in rat

表3　飛機草總黃酮對小鼠糞便大腸埃希菌數的影響Table 3　Effect of flavonoids from Eupatorium odoratum on number of Escherichia coli　　　　　　　107cfu/g

2.5飛機草總黃酮對小鼠血清抗體水平的影響

由表4可知，攻毒1 d時，各組間IgM含量差異無統計學意義（P > 0.05）。攻毒4 d時，各處理組IgM含量高于對照組，差異有統計學意義（P < 0.05），但處理組間差異無統計學意義（P > 0.05）。攻毒7 d后，各組間IgM含量差異無統計學意義（P > 0.05）。由此可見，一定劑量的飛機草總黃酮可提升小鼠血清IgM水平，但持續時間小于7 d。

由表4可知，攻毒1 d，各組間IgA含量與對照組差異無統計學意義（P > 0.05）。攻毒4 d，與對照組相比，處理組IgA含量升高，差異有統計學意義（P < 0.01），但處理組間差異無統計學意義（P > 0.05）。攻毒7 d后，處理組IgA含量稍有下降，但仍高于對照組，差異有統計學意義（P < 0.01），高劑量組高于中、低劑量組及自愈組，差異有統計學意義（P < 0.01）。由此可見，一定劑量的飛機草總黃酮可提升小鼠血清IgA水平，持續時間大于7 d，高劑量組效果更佳。

由表4可知，攻毒1 d后，處理組IgG含量與對照組差異無統計學意義（P > 0.05）。攻毒4 d后，各處理組IgG含量升高，高、中劑量組與對照組差異有統計學意義（P < 0.01），低劑量組及自愈組與對照組差異有統計學意義（P < 0.05），高劑量組高于低劑量組及自愈組，差異有統計學意義（P < 0.05）。攻毒7 d后，各處理組IgG含量升高，高劑量組與對照組差異有統計學意義（P < 0.01），中、低劑量組與對照組差異有統計學意義（P < 0.05）；高劑量組IgG含量高于其他處理組，與中、低劑量組差異有統計學意義（P < 0.05），與自愈組差異有統計學意義（P < 0.01）。由此可見，一定劑量的飛機草總黃酮可提升小鼠血清IgG水平，持續時間大于7 d，高劑量組效果最佳。

表4　飛機草總黃酮對小鼠血清IgM、IgA和IgG的影響Table 4　Effect of flavonoids from Eupatorium odoratum on number of IgM, IgA and IgG in serum of mice　ng/mL

3　討 論

3.1飛機草總黃酮的體外抑菌作用

本研究發現，飛機草總黃酮對4種供試細菌的體外抑菌效果均達中度敏感以上。其中，金黃色葡萄球菌對飛機草總黃酮的敏感性明顯高于雞白痢沙門氏菌和大腸埃希菌。文獻[10-11]表明，黃酮類化合物可破壞細胞膜的功能，抑制細菌的核酸合成及能量代謝。何夢影[12]通過蛋白滲漏和透射電鏡試驗認為，損傷細菌細胞膜是黃酮的主要抑菌機制之一。Yao等[13]發現，黃酮類化合物川陳皮素和橘皮素處理銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）和熒光假單胞菌（P. fluoerncnet）后，在電鏡下觀察可發現細菌的質壁分離現象，細菌結構被破壞。因此推測，本研究的飛機草總黃酮可能具有損傷細菌細胞膜的作用。

3.2飛機草總黃酮的體內抗菌作用

已有研究表明，黃酮對非特異性及特異性免疫均有一定的調節作用。付明哲等[14]研究表明，泡桐（Paulownia）花黃酮可顯著提高腹腔巨噬細胞吞噬指數和吞噬百分率，提高實驗小鼠淋巴細胞轉化率。張蘇倩[15]通過小鼠脾淋巴細胞轉化實驗發現，泡桐花黃酮可促進小鼠脾淋巴細胞轉化增殖，進而促進細胞免疫功能。鄭艷[16]在日糧中添加青刺果（Prinsepia utilis）總黃酮，發現其可顯著提高雛雞（Gallus domestiaus）血清中IgG和lgM含量，對IgA的升高也有促進作用。IgM是機體初次體液免疫應答中最早出現的抗體，是機體抗感染的“先頭部隊”[17]；IgA可在機體黏膜局部抗感染免疫中發揮重要作用[18-19]；IgG則是血清中主要的抗體成分，具有抗菌抗病毒的作用，可在機體免疫中起保護作用[20]。本研究發現，飛機草總黃酮對IgM的影響無統計學意義（P > 0.05），但是高劑量飛機草總黃酮可提高IgA（P < 0.01）和IgG含量（P < 0.05）。小鼠腹腔注射大腸桿菌可造成腸道屏障功能的損傷，腸道微生物平衡紊亂，致病菌在腸道大量增生。高水平的IgA和IgG可有效抵抗細菌感染。本研究中，高劑量總黃酮可有效降低小鼠腹瀉率及糞便大腸桿菌數，說明飛機草總黃酮通過提升機體體液免疫能力而控制腹瀉的發生，而小鼠糞便大腸桿菌數的減少可能還與飛機草總黃酮在腸道內直接抑制致病菌的增值有關。

4　結 論

飛機草總黃酮對受試的4種細菌均有良好的抑菌活性，小鼠通過灌胃黃酮可提高體液免疫。可見飛機草總黃酮具有體內、外抗菌作用，可降低大腸桿菌性腹瀉率，將飛機草作為抗腹瀉中草藥開發利用具有良好的應用前景和環保價值。

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（責任編輯：劉慶穎）

In vitro Antibacterial Activity and in vivo Fighting Escherichia coli Infection of Total Flavonoids from Eupatorium odoratum Linn.

ZHENG Jin-qing, WANG Xiao-ning, YUE Jie, MA Yi, JU Xiang-hong, LIN Hong-ying, CHEN Jin-jun
(Agricultural College, Guangdong Ocean University, Zhanjiang 524088, China)

The flavonoids were extracted from Eupatorium odoratum Linn. and the in vitro antibacterial activities of the flavonoids extract were examined by examining the zone of inhibition, minimal inhibition concentration (MIC) and minimal bactericidal concentration (MBC) against Staphylococcus aureus, Salmonella pullorum, Bacillus subtilis and Escherichia coli. A range of mice were intraperitoneally infected with Escherichia coli and were orally given the flavonoids extract to evaluate the in vivo anti-infection to diarrhea, the number of E. coli in feces and IgM, IgA and IgG in serum of the mice. The results showed that the Staphylococcus aureus responsed most sensitively to the flavonoids, with in vitro inhibition zone diameter of 19.50 mm, along with the MIC of 0.015 6 g/mL and the MBC of 0.031 3 g/mL. It was also found that 160 mg/kg of the flavonoids extract reduced the rate of diarrhea and the fecal coliform count (P < 0.01) and enhanced serum IgA (P < 0.01) and IgG (P < 0.05) in the mice. It was concluded that Eupatorium odoratum flavonoids really had antibacterial effects both in vitro and in vivo.

Eupatorium odoratum Linn.; total flavonoids; antibacterial effect in vitro; anti-infection in vivo

S853.74

A

1673-9159（2015）06-0053-05

10.3969/j.issn.1673-9159.2015.06.010

2015-06-30

廣東省湛江市財政資金科技專項競爭性分配項目“飛機草作為抗菌飼料添加劑資源的開發利用研究”(2013A302-7)

鄭錦慶（1988－），男，在讀碩士生，主要從事動物健康養殖研究，E-mail：417979942@qq.com

林紅英（1965－），女，高級實驗師，主要從事動物藥理和毒理學研究，E-mail：gdoulinhongying@sina.com；陳進軍（1967－），男，博士，教授，主要從事動物藥理和毒理學研究，E-mail：jjchen777@aliyun.com