尤斯灌流技術(shù)在腸道營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)中的研究進(jìn)展

孫飛+方熱軍

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院湖南·長(zhǎng)沙410128）

摘要：尤斯灌流技術(shù)被譽(yù)為腸道屏障功能研究的金標(biāo)準(zhǔn)，關(guān)于尤斯灌流系統(tǒng)在腸道屏障功能研究已成為熱點(diǎn)，但有關(guān)尤斯灌流技術(shù)在營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)方面的研究還很匱乏，本文對(duì)尤斯灌流室的基本原理和構(gòu)造作簡(jiǎn)要綜述，并綜合國(guó)內(nèi)外學(xué)者的研究進(jìn)展，總結(jié)了尤斯灌流技術(shù)在腸道營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)研究中的應(yīng)用。

關(guān)鍵詞：尤斯灌流；腸上皮組織；營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)；轉(zhuǎn)運(yùn)

1951年，丹麥學(xué)者Hans Ussing在對(duì)上皮組織離子轉(zhuǎn)運(yùn)的研究中，首次將Ussing chamber（尤斯室，Ussing灌流室）介紹于世，其主要功能是利用微電極檢測(cè)整個(gè)細(xì)胞膜離子通道變化的電流信號(hào)，來(lái)反映腸道藥物吸收、通透性和分泌情況的變化。近些年來(lái)，關(guān)于尤斯灌流系統(tǒng)在腸道粘膜屏障功能研究已成為熱點(diǎn)，但尤斯灌流系統(tǒng)在腸道營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)中的研究或許可以為養(yǎng)殖生產(chǎn)帶來(lái)更實(shí)際的幫助。

尤斯灌流系統(tǒng)的基本構(gòu)造

尤斯灌流系統(tǒng)主要由灌流室、電路系統(tǒng)、數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)、恒溫裝置以及配套系統(tǒng)組成。常見的灌流室有2、4、6和8室4種類型。根據(jù)工藝不同可將其分為持續(xù)式和循環(huán)式灌流室。持續(xù)式灌流室包括2個(gè)溶液貯器，通過(guò)聚乙烯管道將溶液引入2個(gè)半室，并設(shè)閥門控制流速。循環(huán)式灌流室由1個(gè)U形管道和2個(gè)半室組成，2個(gè)半室中間是1個(gè)用于嵌合組織樣本且可移動(dòng)的滑塊，它可以有效降低灌流過(guò)程中上皮組織所受到的損傷。

上皮組織由密集排列的上皮細(xì)胞和少量細(xì)胞間質(zhì)組成，具有極性和緊密連接，這也是區(qū)別于其他組織的兩大特征。極性是因?yàn)榧?xì)胞游離面（或頂面）和基底面結(jié)構(gòu)和功能的分布不均造成的；而緊密連接又稱閉鎖小帶，常見于單層柱狀上皮和單層立方上皮中，位于相鄰細(xì)胞間隙的頂端側(cè)面，緊密連接除具機(jī)械連接作用外，更重要的是封閉細(xì)胞間隙，阻止細(xì)胞外的大分子物質(zhì)經(jīng)細(xì)胞間隙進(jìn)入組織內(nèi)。緊密連接的形狀和滲透性決定上皮組織的完整性以及對(duì)物質(zhì)的阻抗力。

尤斯灌流系統(tǒng)在腸道營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)中的研究

經(jīng)食道而來(lái)的物質(zhì)在胃和小腸內(nèi)被降解為葡萄糖、小肽、游離脂肪酸和氨基酸等物質(zhì)，通過(guò)胃腸道上皮細(xì)胞基頂膜轉(zhuǎn)運(yùn)載體進(jìn)入胃腸壁內(nèi)，再通過(guò)基底膜轉(zhuǎn)運(yùn)載體轉(zhuǎn)出，進(jìn)入血液循環(huán)供腸道和其他組織利用。提高畜禽胃腸道上皮細(xì)胞的分泌作用對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)效率對(duì)于減少飼養(yǎng)成本，促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)具有重要意義。應(yīng)用尤斯灌流技術(shù)研究營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)在腸道中的轉(zhuǎn)運(yùn)主要集中在葡萄糖、氨基酸以及礦物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)方面。

葡萄糖是自然界分布最廣且最為重要的一種單糖，是生物體內(nèi)新陳代謝不可缺少的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，其主要消化部位在小腸。因此，研究腸道上皮對(duì)葡萄糖的轉(zhuǎn)運(yùn)效率至關(guān)重要。葡萄糖經(jīng)腸道上皮細(xì)胞頂膜Na+-葡萄糖-載體蛋白主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入細(xì)胞，并由基底膜葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入血液。葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中Na+跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)產(chǎn)生的離子電流，為Ussing chamber技術(shù)在葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)研究中的應(yīng)用創(chuàng)造了條件，并以Isc的變化反映葡萄糖的轉(zhuǎn)運(yùn)規(guī)律。Millar等利用Ussing chamber研究表皮生長(zhǎng)因子（EGF）對(duì)兔空腸葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)的影響，其結(jié)果表明EGF通過(guò)PKC和PI3-激酶途徑促進(jìn)3-O-甲基葡萄糖的轉(zhuǎn)運(yùn)。Gar-cia-Amado等利用Ussing chamber技術(shù)研究了鵪鶉腸道D-葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)，黏膜側(cè)加入D-葡萄糖，之后加入根皮苷，試驗(yàn)記錄Isc，發(fā)現(xiàn)，D-葡萄糖增加Isc；根皮苷降低Isc，抑制D-葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)。

氨基酸（Amino acid）是構(gòu)成蛋白質(zhì)的基本單位，賦予蛋白質(zhì)特定的分子結(jié)構(gòu)形態(tài)，使他的分子具有生化活性。蛋白質(zhì)是生物體內(nèi)重要的活性分子，包括催化新陳代謝的酵素和酶。何流琴等在研究缺乏賴氨酸對(duì)大鼠血清氨基酸含量和腸道氨基酸通透性的影響，應(yīng)用尤斯灌流技術(shù)測(cè)定腸道轉(zhuǎn)運(yùn)氨基酸變化及賴氨酸的轉(zhuǎn)運(yùn)能力，該結(jié)果為研究賴氨酸等內(nèi)源性氨基酸的代謝機(jī)制提供了基礎(chǔ)。王斌等在對(duì)豬小腸鈉離子依賴性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)的研究中，利用Ussing chamber技術(shù)研究哺乳仔豬空腸對(duì)六種氨基酸的鈉離子依賴轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制，探討不同濃度氨基酸在空腸轉(zhuǎn)運(yùn)的差異和特點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)氨基酸的轉(zhuǎn)運(yùn)是耗能的主動(dòng)運(yùn)輸過(guò)程；哺乳仔豬空腸對(duì)谷氨酸的轉(zhuǎn)運(yùn)能力很強(qiáng)，其次為蘇氨酸、絲氨酸和甘氨酸，這些氨基酸的轉(zhuǎn)運(yùn)載體多為Na+依賴性的，而羥脯氨酸和精氨酸的轉(zhuǎn)運(yùn)主要不是通過(guò)離子性依賴系統(tǒng)進(jìn)行。

礦物元素也稱無(wú)機(jī)鹽，是構(gòu)成機(jī)體組織的重要物質(zhì)。體內(nèi)礦物元素存在形式多種多樣，但主要是以蛋白質(zhì)及氨基酸相結(jié)合的形式存在，也有以游離狀態(tài)存在。張志博等應(yīng)用尤斯灌流技術(shù)研究厚樸酚與和厚樸酚對(duì)腸道鈣離子轉(zhuǎn)運(yùn)的影響及其抗腹瀉機(jī)制，結(jié)果表明，厚樸酚與和厚樸酚均可不同程度影響IEC-6細(xì)胞內(nèi)鈣離子的轉(zhuǎn)運(yùn)，可通過(guò)細(xì)胞膜上的電壓依賴性鈣通道以及受體操控型鈣通道來(lái)調(diào)節(jié)胞內(nèi)鈣庫(kù)的釋放和胞外鈣的內(nèi)流來(lái)影響細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度，并達(dá)到抗腹瀉作用。賀志雄等應(yīng)用尤斯灌流法測(cè)定斷奶后羔羊胃腸道消化吸收能力，結(jié)果表明，動(dòng)物體生命早期不同時(shí)期瘤胃、空腸和回腸有著不同的分泌、屏障及吸收特征； 1-2周（斷奶過(guò)渡期）腸道結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生紊亂，可能導(dǎo)致動(dòng)物產(chǎn)生腹瀉。

瘤胃上皮不僅是瘤胃微生物附著生長(zhǎng)并進(jìn)行消化和代謝的主要部位也是營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收轉(zhuǎn)運(yùn)代謝的主要場(chǎng)所，同時(shí)瘤胃上皮組織較其他組織更適合進(jìn)行物質(zhì)吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)以及代謝研究。利用尤斯灌流技術(shù)對(duì)瘤胃上皮組織的研究或許是今后研究的熱點(diǎn)，同時(shí)也可以為瘤胃上皮對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收與轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制提供更為準(zhǔn)確的理論依據(jù)。

優(yōu)點(diǎn)與缺點(diǎn)分析

優(yōu)點(diǎn)：尤斯灌流技術(shù)提供一個(gè)短期的離體組織培養(yǎng)的方法，較之傳統(tǒng)的體外培養(yǎng)方法具有快捷，簡(jiǎn)便等特點(diǎn)，通過(guò)對(duì)轉(zhuǎn)運(yùn)電流等一些列的電參數(shù)的測(cè)定，用以說(shuō)明是否有載體或外流泵參與轉(zhuǎn)運(yùn)；能對(duì)轉(zhuǎn)運(yùn)的不同階段進(jìn)行研究。尤斯灌流系統(tǒng)的研究對(duì)象為上皮組織，而上皮組織廣泛分布在身體表面和體內(nèi)各種囊、管、腔的內(nèi)表面。上皮組織具有保護(hù)、分泌、吸收和排泄等功能，不同部位的不同上皮其功能各有差異。如分布在身體表面的上皮以保護(hù)功能為主；體內(nèi)各管腔面的上皮，除具有保護(hù)功能外尚有分泌和吸收等功能；某些上皮組織，從表面生長(zhǎng)到深部結(jié)締組織中去，分化成為具有分泌功能的腺上皮。因此，尤斯灌流的研究對(duì)象可擴(kuò)展到機(jī)體任意上皮組織。就某一具體上皮組織而言，可研究的內(nèi)容也更加多樣。

缺點(diǎn)：研究對(duì)象單一，尤斯灌流系統(tǒng)研究對(duì)象為上皮組織，很少涉及細(xì)胞學(xué)研究，特別是對(duì)細(xì)胞內(nèi)藥物吸收與轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制的研究。用一個(gè)相對(duì)少量的測(cè)量來(lái)解釋復(fù)雜的腸粘膜上皮組織的生理系統(tǒng)，無(wú)法考慮細(xì)胞間和旁分泌所帶來(lái)的影響。胃腸道上皮離體后組織形態(tài)學(xué)和生理活性都會(huì)在一定時(shí)間之后迅速改變或下降，有研究表明Soderholm，腸道上皮離體90-120min后大部分標(biāo)本都出現(xiàn)了組織形態(tài)學(xué)的改變，生理活性無(wú)明顯異常。離體240min后ATP降低至正常值的30%，組織的通透性明顯提高，這與實(shí)際應(yīng)用有所矛盾。灌流室片組織樣品固定夾與都是固體，難以保證其密封性，在利用尤斯灌流室研究物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)有漏液的情況出現(xiàn)，溶液是從安插組織樣品固定夾片的位置滲漏，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性造成嚴(yán)重的影響。

尤斯灌流技術(shù)是一種首先用于研究離子通道而逐步發(fā)展起來(lái)的技術(shù)，以其快捷、簡(jiǎn)便等特點(diǎn)，并它能比較真實(shí)地反映各種上皮細(xì)胞在體內(nèi)的實(shí)時(shí)狀態(tài)，受到廣大醫(yī)藥學(xué)領(lǐng)域工作者的青睞。隨著這一技術(shù)的不斷完善，尤斯灌流技術(shù)必將為畜禽胃腸道屏障功能和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程與機(jī)制研究作出重要貢獻(xiàn)。

參考文獻(xiàn)（略）