犬心絲蟲病的實(shí)驗(yàn)室檢查方法

甄森萍　馬黎明

1.青海省西寧市動(dòng)物檢疫站，青海西寧810003；2.青海畜牧獸醫(yī)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，青海湟源812100

犬心絲蟲病的實(shí)驗(yàn)室檢查方法

甄森萍1馬黎明2

1.青海省西寧市動(dòng)物檢疫站，青海西寧810003；2.青海畜牧獸醫(yī)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，青海湟源812100

犬心絲蟲病是由犬心絲蟲寄生于犬的右心室及肺動(dòng)脈（少見于胸腔、支氣管內(nèi)）引起循環(huán)障礙、呼吸困難、貧血等癥狀的一種絲蟲病。本文總結(jié)了直接檢查、薄血涂片檢查、厚血涂片檢查、淡黃層檢查法、改良的諾茨技術(shù)、過濾技術(shù)、酶聯(lián)免疫吸附法等檢查犬心絲蟲病的方法。

犬；心絲蟲病；實(shí)驗(yàn)室檢查；血液

犬心絲蟲（Dirofilariaimmitis）病，是由犬心絲蟲寄生于犬的右心室及肺動(dòng)脈（少見于胸腔、支氣管內(nèi)）引起循環(huán)障礙、呼吸困難及貧血等癥狀的一種絲蟲病。心絲蟲是動(dòng)物心血管系統(tǒng)中最常見的寄生蟲，除感染犬外，貓及其他野生肉食動(dòng)物也可被感染。

1　血液樣品的采集

從動(dòng)物身體采集血樣需要已消毒的器械和酒精。血液可用注射針管和針頭或真空采血管來采集。所有樣品應(yīng)標(biāo)記畜主的名字、動(dòng)物的名字和采集日期。血流中微絲蚴在1d中的特定時(shí)間內(nèi)數(shù)量較多。為提高微絲蚴的采集數(shù)量，應(yīng)該下午采集，因?yàn)槿慕z蟲的微絲蚴在這一時(shí)段的循環(huán)中數(shù)量最多。

2　血液的檢查

應(yīng)記錄血液的大體檢查結(jié)果。例如，血樣稀薄反應(yīng)動(dòng)物貧血。血液的臨床病理學(xué)檢查也有助于寄生蟲的診斷。犬心絲蟲的微絲蚴可在進(jìn)行白細(xì)胞分類計(jì)數(shù)時(shí)觀察到。嗜酸性粒細(xì)胞的數(shù)量也表明可能有寄生蟲病。

1）使用材料。血液采集用品、載玻片和蓋玻片。

2）檢查方法。采血后立即將1滴血滴到載玻片上，蓋上蓋玻片；在10倍物鏡下檢查，觀察紅細(xì)胞間適合蟲體運(yùn)動(dòng)的區(qū)域，易于發(fā)現(xiàn)寄生蟲的存在。

3　直接檢查

直接檢查血液中的微絲蚴是最簡單的方法。此方法主要檢測(cè)微絲蚴和其它寄生蟲在紅細(xì)胞間的運(yùn)動(dòng)。與直接檢測(cè)糞便相似，血樣的直接檢測(cè)只需要很少的樣品。然而除非寄生蟲呈現(xiàn)很大的數(shù)量，否則很可能會(huì)出現(xiàn)漏檢。

微絲蚴主要的關(guān)注點(diǎn)在與犬心絲蟲和隱匿雙瓣線蟲（Dipetalonemareconditum），后者為犬的皮下寄生蟲。二者的區(qū)分十分重要，因?yàn)樾慕z蟲的治療很昂貴，還有些應(yīng)激，并且經(jīng)常會(huì)用到較強(qiáng)的毒性物質(zhì)。在直接血涂片上，心絲蟲的微絲蚴有盤繞的和非盤繞的，而隱匿雙瓣線蟲的微絲蚴可以流暢地在玻片上滑動(dòng)。在一個(gè)樣品中心絲蟲的微絲蚴的數(shù)目比隱匿雙瓣線蟲的微絲蚴多許多。血液的直接檢查只是用于確定微絲蚴的存在，并非種類。因此，可選用一種可使微絲蚴“放松”并染色的濃縮方法來鑒定蟲種。

錐蟲是另外一種血液寄生蟲。在稀釋血細(xì)胞的涂片中可見錐蟲游走在細(xì)胞間（單細(xì)胞厚），但在染色涂片中更容易鑒定。在大動(dòng)物體內(nèi)也可發(fā)現(xiàn)微絲蚴。腹腔絲蟲是在牛和馬腹腔漿膜中發(fā)現(xiàn)的白色的、較長的線蟲。在進(jìn)行腹腔手術(shù)時(shí)經(jīng)常看到成蟲，并且在白細(xì)胞分類計(jì)數(shù)時(shí)可見其微絲蚴。

4　薄血涂片檢查

薄血涂片的制作和染色方法與用于白細(xì)胞分類計(jì)數(shù)的血涂片的方法是相同的。在做白細(xì)胞分類計(jì)數(shù)時(shí)，獸醫(yī)技術(shù)員應(yīng)當(dāng)記錄觀察到的任何寄生蟲。偶爾可見微絲蚴。由于它們較小，微絲蚴經(jīng)常出現(xiàn)在血膜的羽毛形邊緣。由于在薄血涂片上區(qū)分微絲蚴是不可能的，所以要進(jìn)行鑒定還需用其他方法。在細(xì)胞間或細(xì)胞內(nèi)也可發(fā)現(xiàn)錐蟲、原蟲和立克次氏體。像直接涂片法一樣，此法只用少量血液樣品，輕度寄生蟲感染可能會(huì)被忽略掉。

5　厚血涂片檢查

厚血涂片檢查比薄血涂片用的血液稍多。同樣可見微絲蚴，但用這種方法不能對(duì)它進(jìn)行鑒定。

1）使用材料。載玻片、蒸餾水、甲醇、姬姆薩染液、用蒸餾水1∶20稀釋、木質(zhì)棉簽。

2）檢查方法。在蓋玻片上滴3滴血，用棉簽將它涂成直徑為2cm的圓，載玻片自然干燥，將載玻片傾斜放置于盛有蒸餾水的燒杯中，涂面朝下，使載玻片浸入水中直到涂層的紅色退去。取出載玻片，自然干燥。將載玻片浸入甲醇10min，用姬姆薩染液染色30min。漂洗除去多余染料。

6　淡黃層檢查法

淡黃層檢查法是針對(duì)少量血液的濃縮方法。當(dāng)血液注入微量血細(xì)胞比容管并離心來確定血細(xì)胞壓積時(shí)，血液分為3層：血漿、白細(xì)胞層（淡黃層）和紅細(xì)胞層。微絲蚴在淡黃層的表面。此方法快捷并且可以和血細(xì)胞壓積和總蛋白測(cè)定等實(shí)驗(yàn)同時(shí)做。但是不能進(jìn)行微絲蚴的鑒定。濃縮方法可將犬心絲蟲和隱匿雙瓣線蟲區(qū)分開。

1）使用材料。微量血細(xì)胞比容管和密封器、顯微血細(xì)胞壓積測(cè)定離心機(jī)、小銼刀或玻璃刀、載玻片和蓋玻片、鹽水、甲基藍(lán)染液（用蒸餾水做1∶1000稀釋）。

2）檢查方法。向微量血細(xì)胞比容管內(nèi)注入血液并封口，離心3min。

如果需要可先讀取血細(xì)胞壓積。然后可找到在紅細(xì)胞和血漿之間的淡黃層；用銼刀在淡黃層部位的管壁上劃線。小心掰開管子并保留含有血漿和淡棕黃層的部分。在一個(gè)載玻片上輕敲管子，使淡黃層伴著少量血漿彈出。如果需要，可保留其余的血漿用于總蛋白測(cè)定；向淡黃層加入1滴鹽水和1滴染液，蓋上蓋玻片并檢查微絲蚴。

7　改良的諾茨技術(shù)

改良的諾茨技術(shù)是能使不同微絲蚴區(qū)分開的簡單方法。這項(xiàng)技術(shù)通過使紅細(xì)胞裂解，使微絲蚴更加明顯，再進(jìn)行微絲蚴濃縮、松弛并染色。

1）使用材料。15mL離心管、離心機(jī)、2%福爾馬林（用98mL蒸餾水稀釋2mL40%福爾馬林）、甲基藍(lán)（用蒸餾水1∶1000稀釋）、巴斯德吸管和吸球。

2）檢查方法。將1mL血液與9mL2%福爾馬林在離心管中混合；離心5min，1300～1500 r/min；傾去上清液，使沉淀留在管底；向沉淀加2～3滴染液，用吸管將染液與沉淀混合。在玻片上滴1滴混合液，蓋上蓋玻片，然后鏡檢。獸醫(yī)技術(shù)員應(yīng)該檢查盡可能多的微絲蚴，因?yàn)榭赡軙?huì)出現(xiàn)混合感染。最精確的鑒定方法是測(cè)量蟲體的長和寬。然而在一些實(shí)際情況中，如果無法測(cè)量微絲蚴，則可根據(jù)微絲蚴的一般特征來鑒別（表1）。

表1　改良的諾茨技術(shù)鑒別微絲蚴

8　過濾技術(shù)

過濾技術(shù)是在獸醫(yī)檢測(cè)血液中微絲蚴的一個(gè)常用方法。一個(gè)很好的診斷試劑盒，Di-Fil檢測(cè)試劑盒便采用了這種方法。此試劑盒包括濾器、裂解液、染色劑和使用說明。多數(shù)試劑盒需加1mL全血來檢測(cè)心絲蟲。1份血液混入9份的裂解液并且通過濾膜過濾。清洗濾膜，將其放在載玻片上，加1滴染色液，蓋上蓋玻片。在顯微鏡下檢查微絲蚴。采用過濾技術(shù)區(qū)分不同的微絲蚴是有可能的，但很困難。如果存在微絲蚴，在鑒定微絲蚴時(shí)建議采用其他診斷方法。

9　酶聯(lián)免疫吸附法

酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）試劑盒不直接檢測(cè)微絲蚴，而是檢測(cè)宿主對(duì)寄生蟲的反應(yīng)。這種試驗(yàn)可用于區(qū)分犬心絲蟲和隱匿雙瓣線蟲；也可用于心絲蟲的隱性感染，即在外周血中未發(fā)現(xiàn)微絲蚴的時(shí)候。發(fā)生隱性感染可能有以下幾種情況，只出現(xiàn)在1只成蟲；只出現(xiàn)1種性別的成蟲（所有的都是雄性蠕蟲或雌性蠕蟲）；成蟲不能繁殖；當(dāng)蠕蟲進(jìn)行繁殖的時(shí)候，動(dòng)物的免疫系統(tǒng)清除了微絲蚴；或者是動(dòng)物用藥后殺死了循環(huán)系統(tǒng)的微絲蚴或致使成蟲沒有繁殖能力。在以上所有的情況下，在外周血中都未發(fā)現(xiàn)微絲蚴。一些ELISA試劑盒可用于檢測(cè)宿主對(duì)犬心絲蟲的抗體反應(yīng)，而另一些則用于檢測(cè)宿主對(duì)微絲蚴的抗體反應(yīng)。許多用于犬、貓的犬心絲蟲成蟲抗原的商品化ELISA檢測(cè)試劑盒已經(jīng)在獸醫(yī)臨床實(shí)踐中得到常規(guī)應(yīng)用。獸醫(yī)技術(shù)員首先應(yīng)認(rèn)真閱讀操作說明。像許多方法一樣，ELISA免疫診斷檢測(cè)應(yīng)當(dāng)嚴(yán)格按照說明來操作并且要在清潔的環(huán)境中使用和保存以防污染。這些ELISA檢測(cè)已商品化且非常快速。大多數(shù)檢測(cè)試驗(yàn)是靠試劑盒顏色的變化來判斷一個(gè)動(dòng)物是否感染犬心絲蟲成蟲。獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)員在使用這些試劑盒時(shí)應(yīng)當(dāng)謹(jǐn)慎，因?yàn)樵诟腥净蛭锤腥镜娜垼加谐霈F(xiàn)假陰性或假陽性的可能。另外，這些檢測(cè)不應(yīng)單獨(dú)用于診斷。偶爾，ELISA結(jié)果為陰性，而血液中檢出微絲蚴，這種結(jié)果常會(huì)令人懷疑檢測(cè)方法的可靠性。在心絲蟲診斷中抗原檢測(cè)是很有用的。但是，獸醫(yī)技術(shù)員應(yīng)當(dāng)認(rèn)識(shí)到這個(gè)方法作為獨(dú)立檢測(cè)實(shí)驗(yàn)的局限性。

10　其他檢查方法

若微絲蚴是活的，可用另一種與諾茨法過濾技術(shù)原理相同的診斷檢測(cè)試劑盒來檢測(cè)心絲蟲。這種檢測(cè)依賴微絲蚴的運(yùn)動(dòng)，該方法有時(shí)不可靠。其他檢測(cè)方法是利用特殊染色來顯示微絲蚴的特征，但這些方法很繁瑣，不適合私人診所使用，而通常用于診斷實(shí)驗(yàn)室。

2015-05-22

甄森萍，女，1973年生，中級(jí)獸醫(yī)師。