敗醬皂苷對照品制備工藝研究△

陸昊，劉宏尉，王增尚，劉江云，郝麗莉，楊世林

(蘇州大學 藥學院，江蘇 蘇州 215123)

·中藥工業·

敗醬皂苷對照品制備工藝研究△

陸昊，劉宏尉，王增尚，劉江云*，郝麗莉，楊世林

(蘇州大學 藥學院，江蘇 蘇州 215123)

目的：對黃花敗醬總皂苷進行分離，以獲得高純度的3種敗醬皂苷對照品。方法：綜合采用多種硅膠、反相硅膠、凝膠柱色譜和中壓、高壓制備色譜技術，對敗醬總皂苷進行分離純化，采用HPLC-ELSD檢測樣品含量。結果：制備獲得的化合物1～3峰純度均為98.9%以上。結論：該制備工藝簡潔、高效，可獲得高純度的敗醬皂苷對照品。

敗醬；皂苷；對照品；分離

敗醬是傳統中藥，始載于《神農本草經》，列為中品，其性微寒，味苦、辛，歸肺、大腸、肝經。具有清熱解毒，排膿破瘀之功能，可用于治療腸癰、下痢、赤白帶下、產后瘀滯腹痛、目赤腫痛、癰腫疥癬等癥。現代研究證明敗醬具有鎮靜催眠、抗菌、抗病毒、抗腫瘤、保肝利膽等多種藥理作用，臨床上可用于治療神經衰弱、肝炎、肝硬化、流行性腮腺炎、鼻竇炎和結腸炎等[1]。

本課題組對黃花敗醬中的化學成分進行系統分離，鑒定了主要的17種三萜皂苷及其他化合物[2-4]。進一步研究及文獻[5]分析結果表明，齊墩果酸型皂苷具有較好的抗腫瘤活性。本文報道敗醬總皂苷中3種主要成分對照品的制備工藝，為黃花敗醬的后續研究與開發提供參考。

1 儀器、材料與試劑

1.1 儀器

高效液相色譜系統(LC-20AD輸液泵、SPD-M20A紫外檢測器、CTO-20A柱溫箱、LC-Solution色譜工作站，日本島津公司)；ODS色譜柱(PAQ-C18，日本Cosmosil公司)；BP-Purifier-100中壓液相系統(蘇州利穗有限公司)；HB-DAC-100動態軸向制備柱系統(江蘇漢邦科技有限公司)；Agilent-6100系列LCMS系統；Avance III plus 400 MHz核磁共振儀(德國Bruker Daltonics)。

1.2 材料

黃花敗醬的全草(云南蒙自縣，批次：PS121010)于2012年6～8月間采集，經蘇州大學陸

葉博士鑒定為敗醬科敗醬屬植物黃花敗醬PatriniascabiosaefoliaFisch.的全草。

1.3 試劑

大孔吸附樹脂LX60(西安藍曉科技有限公司)；硅膠300～400目(青島海洋化工有限公司)；反相C18硅膠(75 μm，日本Cosmosil公司)；Sephadex LH-20凝膠(美國GE公司)；甲醇(色譜純，上海化學試劑有限公司)；純凈水(杭州娃哈哈公司)；去離子水(自制)；其他試劑均為分析純。

2 方法

2.1 液相分析條件

采用高效液相-蒸發光散射檢測(HPLC-ELSD)分析方法，液相分析條件：蒸發光散射檢測器的漂移管溫度為40 ℃；霧化氣壓力為350 kPa；氮氣流速為2.5 L·min-1；流動相為甲醇(A)-0.5%甲酸水溶液(B)，梯度洗脫(0～30 min，70%→100%A)；柱溫為35 ℃；流速為1 mL·min-1；進樣量為20 μL。

2.2 黃花敗醬總皂苷的制備

筆者根據抗腫瘤藥理實驗結果，研究建立了總皂苷精制工藝：取黃花敗醬全草20 kg，用10倍量75%乙醇回流提取兩次，每次2 h，合并提取液，濃縮，加水至40 L，用氫氧化鈉(NaOH)調節pH至11～13之間，保持微沸水解4 h，靜置放冷，以氯化氫(HCl)調節pH至10，加水至40 L，上大孔吸附樹脂(20 L·BV-1)，以水(4 BV)、10%乙醇(4 BV)、80%乙醇(6 BV)洗脫；收集80%乙醇洗脫部位，濃縮，干燥，即得敗醬總皂苷(170 g)。見圖1。

注：1～3.敗醬皂苷，結構式參見圖2。圖1 敗醬總皂苷HPLC圖

3 結果

3.1 分離純化

稱取敗醬總皂苷20 g，經減壓硅膠柱柱色譜，以三氯甲烷-甲醇(10∶1→5∶5)系統溶劑梯度洗脫，TLC檢測，合并相同組分，獲得流分F1～F16。

取F9(4.23 g)經硅膠H柱分離，氯仿-甲醇(CHCl3-CH3OH)(9∶1→8∶2)梯度洗脫，獲得F9.1～F9.6，其中F9.3上中壓反相碳18硅膠(ODS)柱，以CH3OH-H2O 40∶60、60∶40、65∶35、100∶0分段洗脫，其中65%洗脫流分經高效液相色譜法(HPLC)檢測合并，濃縮后經Sephadex LH-20，以CHCl3-CH3OH(1∶1)純化，獲得化合物1(0.45 g)，按液相相對峰面積計純度為99.1%。

取F12(8.16 g)經硅膠H柱分離，CHCl3-CH3OH(7∶3→5∶5)梯度洗脫，獲得F12.1～F12.9，合并F12.5～F12.7上中壓ODS柱，以CH3OH-H2O 40∶60、75∶25、100∶0分段洗脫，其中75%流分合并，進一步經反相動態軸向柱色譜以CH3OH-H2O按70∶30(F12.5.1～F12.5.4)、75∶25(F12.5.5～F12.5.15)、100∶0(F12.5.16～F12.5.20)進行分離，其中流分F12.5.8～F12.5.11、F12.5.13～F12.5.14分別經HPLC檢測合并，經Sephadex LH-20，以CHCl3-CH3OH(1∶1)純化，依次獲得化合物2(82 mg)、3(0.95 g)，按液相相對峰面積計純度依次為98.9%、99.2%。

3.2 結構鑒定

筆者采用HR-ESI-MS、1H-NMR、13C-NMR等譜學技術，參考相關文獻，對化合物1～3進行結構鑒定，各化合物結構式見圖2。

圖2 敗醬皂苷1～3結構式

化合物1：白色無定形粉末(甲醇)。HR-ESI-MS給出[M-H]-準分子離子m/z881.480 2(計算值為881.484 5)，相應分子式為C46H72O16。1H-NMR(400 MHz，C5D5N)和13C-NMR(100 MHz，C5D5N)數據與文獻[4]報道的3-O-β-D-吡喃木糖基-(1→3)-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)-β-D-吡喃木糖基-11α，12α-環氧齊墩果烷-28，13β-交酯一致。

化合物2：白色粉末(甲醇)，在TLC板上用10%硫酸-乙醇顯色為紫紅色，HR-ESI-MS給出[M-H]-準分子離子m/z 1 028.552 5(計算值為1 028.56)，相應分子式為C52H84O20。1H-NMR(400 MHz，C5D5N)δ：6.38(1H，br s，H-1 of Rha)，5.26(1H，d，J=8.0 Hz，H-1′ of Xyl′)，5.12(1H，d，J=8.0 Hz，H-1 of Glc)，4.86(1H，d，J=7.0 Hz，H-1 of Xyl)，5.26(1H，br s，H-12)，1.42(3H，d，J=6.0 Hz，CH3-6 of Rha)，1.15(3H，s，CH3-23)，1.10(3H，s，CH3-27)，1.05(3H，s，CH3-24)，1.01(3H，s，CH3-26)，0.81(3H×3，s，CH3-29，30，25)；13C-NMR(100 MHz，C5D5N)數據見表1。以上數據與文獻[3，6]報道的3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-β-D-吡喃木糖基-(1→3)-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)-β-D-吡喃木糖基-齊墩果酸-28-O-β-D-吡喃葡萄糖苷比較，為該化合物經堿水解脫去28-葡萄糖基的次生皂苷，鑒定其為齊墩果酸-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-β-D-吡喃木糖基-(1→3)-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)-β-D-吡喃木糖苷。

化合物3：白色粉末(甲醇)，HR-ESI-MS給出[M-H]-準分子離子m/z 865.497 1(計算值為865.498 0)，相應分子式為C46H74O15。1H-NMR(400 MHz，C5D5N)δ：6.59(1H，s，H-1 of Rha)，5.45(1H，d，J=7.5 Hz，H-1′ of Xyl′)，5.01(1H，d，J=7.0 Hz，H-1 of Xyl)，5.39(1H，br s，H-12)，1.63(3H，d，J=6.0 Hz，CH3-6 of Rha)，1.39(3H，s，CH3-23)，1.30(3H，s，CH3-27)，1.21(3H，s，CH3-24)，0.99(3H，s，CH3-26)，0.96(3H，s，CH3-29)，0.94(3H，s，CH3-30)，0.82(3H，s，CH3-25)；13C-NMR(100 MHz，C5D5N)數據見表1。以上數據與文獻[4，6]報道的3-O-β-D-吡喃木糖基-(1→3)-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)-β-D-吡喃木糖基-齊墩果酸-28-O-β-D-吡喃葡萄糖苷比較，為該化合物經堿水解脫去28-葡萄糖基的次生皂苷，鑒定其為齊墩果酸-3-O-β-D-吡喃木糖基-(1→3)-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)-β-D-吡喃木糖苷。

表1 化合物2和3的13C-NMR數據(100 MHz，C5D5N)

4 結論

敗醬中的化學成分復雜，對照品分離較為困難。本文首先采用大孔樹脂精制技術，能夠有效富集總皂苷；對其中的主要成分，先采用減壓硅膠柱色譜進行快速分段，再采用硅膠和反相硅膠柱色譜，分離純化各化合物；對難以分離的2個化合物PSH-2和PSH-3，采用反相高壓制備柱色譜技術進行分離；終端純化采用Sephadex凝膠柱色譜，進一步除去其他殘余雜質，提高產品純度。通過上述分離純化技術的綜合應用，最終成功獲得3種目標產物對照品。結果表明該分離方法較為簡潔、高效，為進一步開發利用黃花敗醬提供參考。

植物藥化學成分復雜，成分相對含量不一，因為質量研究中所需的特定對照品純度要求高，標定用量大，所以對其分離純化工作量大，獲取難度高。近年來，隨著多種分離填料以及制備用中壓和高壓液相色譜儀器的普及，分離工作帶得到了很大改善。本課題組研究表明，上述對照品制備技術作為一種通用流程，也可為其他高純度成分的制備提供借鑒[7-8]。

[1] 劉明生，陳英杰，卜月華，等.黃花敗醬研究進展[J].沈陽藥學院學報，1993，10(4)：301-304.

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[3] Gao L，Zhang L，Li N，et al.New triterpenoid saponins fromPatriniascabiosaefolia[J].Carbohyd Res，2011，346(18)：2881-2885.

[4] Gao L，Zhang L，Wang L M，et al.New triterpenoid saponins fromPatriniascabiosaefolia[J].J Asian Nat Prod Res，2012，14(4)：333-341.

[5] Xu Q M，SHU Z，HE W J，et al.Antitumor activity ofPulsatillachinensis(Bunge)Regel saponins in human liver tumor 7402 cells in vitro and in vivo[J].Phytomedicine，2012，19(3-4)：293-300.

[6] Tian J，Wu F E，Qiu M H，et al.Triterpenoid saponins fromPterocephalushookeri[J].Phytochemistry，1993，32(6)：1535-1538.

[7] WANG L，Xu Q，Su S，et al.Simultaneous purification of Pulchinenoside B4and B5fromPulsatillachinensisusing macroporous resin and preparative high performance liquid chromatography[J].Ind Eng Chem Res，2012，51(45)：14859-14866.

[8] 劉慧璐，馮建勇，王增尚，等.高色價梔子黃的精制工藝研究[J].中國現代應用藥學，2013，30(12)：1315-1319.

SeparationofReferenceCompoundsfromTotalSaponinofPatriniascabiosaefolia

LUHao，LIUHongwei，WANGZengshang，LIUJiangyun*，HAOLili，YANGShilin

(CollegeofPharmaceuticalSciences，SoochowUniversity，Jiangsu，Suzhou，215123，China)

Objective：This study managed to develop an efficient separation process to afford 3 saponins as reference compounds fromPatriniascabiosaefoliaFisch.Methods：The process was conducted using multiple column chromatographies including silica gel，reversed-phase silica gel，sephadex gel columns，and preparative middle-/high-pressure liquid chromatography.The HPLC/ELSD method was applied for purity analysis of samples.Results：Three saponins1-3were obtained with their purities above 98.9%.Conclusion：The separation process developed was highly efficient and compact，which resulted in target compounds with high purities.

Patriniascabiosaefolia；saponin；reference compound；separation

10.13313/j.issn.1673-4890.2015.6.015

2014-11-17)

江蘇省科技支撐計劃社會發展項目(BE2012649)

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劉江云，副教授，研究方向：天然藥物化學；Tel：(0512)65884301，E-mail：liujiangyun@suda.edu.cn