奧扎格雷對(duì)酪氨酸酶的抑制機(jī)理

趙仕芝

摘 要：奧扎格雷不僅能抑制酪氨酸酶單酚酶的活性，而且能夠抑制酪氨酸酶二酚酶的活性。對(duì)單酚酶的抑制作用主要表現(xiàn)為抑制酶活，并且使得酶催化反應(yīng)的延滯時(shí)間有明顯的延長，而對(duì)二酚酶的抑制作用，主要表現(xiàn)為抑制二酚酶酶活。同時(shí)，討論了酚氧化酶的催化氧化的機(jī)理：酶和底物結(jié)合后，會(huì)形成一個(gè)新的疏水性的“口袋”，抑制劑奧扎格雷會(huì)嵌入這個(gè)“口袋”，形成酶-底物-抑制劑復(fù)合物ESI。

關(guān)鍵詞：酪氨酸酶 奧扎格雷 單酚酶 二酚酶 抑制機(jī)理

中圖分類號(hào)：Q356.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1672-3791（2015）06（c）-0249-02

奧扎格雷（ozagrel）是一種新型抗血小板聚集藥，藥理研究表明，奧扎格雷能強(qiáng)力抑制TXA2合成酶的活性，從而抑制血小板聚集，同時(shí)提高前列環(huán)素PGI2的濃度，擴(kuò)張血管，增加血流量，有效抑制腦血栓的形成，使已形成的血栓靠血液平衡關(guān)系的打破而被自行溶解，達(dá)到治療腦梗塞之功效。該文研究了奧扎格雷對(duì)蘑菇酪氨酸酶的抑制動(dòng)力學(xué)。該研究結(jié)果為進(jìn)一步的設(shè)計(jì)高效酪氨酸酶抑制劑奠定理論基礎(chǔ)，并為奧扎格雷及其衍生物作為食品防腐劑、果蔬保鮮劑以及美白化妝品的添加劑闡明了它們作用的酶學(xué)機(jī)理，為新型高效酪氨酸酶抑制劑的開發(fā)提供了新的分子模板。

1 實(shí)驗(yàn)方法

1.1 酪氨酸酶活力測(cè)定

酪氨酸酶單酚酶活力測(cè)定：1.5mmol/LL-酪氨酸為底物，在pH6.8的磷酸鹽緩沖液中，30℃恒溫10分鐘，加入不同濃度的奧扎格雷溶液和酶溶液，在475nm波長下測(cè)定吸光度OD值。

酪氨酸酶二酚酶活力測(cè)定：1.0mmol/LL-DOPA為底物，在pH 6.8的磷酸鹽緩沖液中，30℃恒溫10分鐘，加入不同濃度的奧扎格雷溶液和酪氨酸酶溶液，在475nm波長下測(cè)定吸光度OD值。

2 結(jié)果與討論

2.1 奧扎格雷對(duì)酪氨酸酶單酚酶的影響

如圖1所示，奧扎格雷具有抑制蘑菇酪氨酸酶單酚酶酶活。測(cè)定不同濃度的奧扎格雷濃度對(duì)酪氨酸酶單酚酶作用的進(jìn)程曲線，曲線1-5分別表示奧扎格雷在測(cè)酶活體系中的濃度為0、10、20、30和40mol/L。圖1結(jié)果表明，奧扎格雷能延長酶反應(yīng)的延滯時(shí)間（曲線的直線部分交于X軸的值），并隨著奧扎格雷濃度的增大而延長。在相同反應(yīng)時(shí)間下，反應(yīng)體系的吸光度值隨著奧扎格雷濃度的增大而下降，說明奧扎格雷對(duì)酪氨酸酶的單酚酶活性有抑制作用。延滯期過后，酶催化體系逐漸達(dá)到了穩(wěn)態(tài)（曲線的直線部分）。相對(duì)抑制率達(dá)到50%的奧扎格雷濃度（IC50）為1.35mmol/L。

2.2 奧扎格雷對(duì)酪氨酸酶二酚酶的影響

以L-DOPA為底物測(cè)定酪氨酸酶二酚酶酶活，反應(yīng)進(jìn)程曲線如圖2 （曲線0-5）。在測(cè)活條件體系中，加入酶液后，反應(yīng)迅速進(jìn)入穩(wěn)態(tài)，產(chǎn)物與時(shí)間呈線性遞增，直線部分為酶催化底物反應(yīng)級(jí)數(shù)為一級(jí)反應(yīng)，隨著時(shí)間的延長，酶受到奧扎格雷的抑制，導(dǎo)致酶活下降，從而反應(yīng)級(jí)數(shù)逐漸的由一級(jí)反應(yīng)轉(zhuǎn)變?yōu)榱慵?jí)反應(yīng)。在不同的奧扎格雷濃度條件下，隨著奧扎格雷濃度的增加，一級(jí)反應(yīng)區(qū)域 （曲線直線部分） 的斜率逐漸減小，即奧扎格雷對(duì)酪氨酸酶二酚酶酶活的抑制程度增大。

2.3 催化機(jī)理

在氧氣存在條件下，酪氨酸酶的基本功能有兩個(gè)：作為單酚酶羥基化單酚生成鄰二酚（圖3）；作為雙酚酶氧化鄰二酚生成醌（圖4）。該酶具有包含兩個(gè)銅離子位點(diǎn)的活性中心，并與不同數(shù)目的氧原子配位結(jié)合具有三種不同狀態(tài)，分別為氧化態(tài)Eoxy，還原態(tài)Emet和脫氧態(tài)Edeoxy。氧化態(tài)Eoxy兼具單酚酶和二酚酶的活性；還原態(tài)Emet具有二酚酶的活性，不具有單酚酶活性，但是和單酚底物具有親和作用，所以還原態(tài)Emet是延滯效應(yīng)產(chǎn)生的原因；脫氧態(tài)Edeoxy的作用是只能結(jié)合氧。所以，酪氨酸酶催化單酚類底物都是從Eoxy開始，Emet和Edeoxy均不與單酚類底物反應(yīng)，Eoxy和Emet兩者都可以催化多酚類底物。

奧扎格雷能夠延長單酚酶的延滯時(shí)間，降低單酚酶和二酚酶的穩(wěn)態(tài)速率，說明奧扎格雷能夠可逆的抑制酪氨酸酶并阻止多巴色素的生成，進(jìn)而能夠遏制黑色素的生成。并且，對(duì)于二酚酶體系而言，奧扎格雷不僅能和還原態(tài)酶Emet和氧化態(tài)酶Eoxy結(jié)合分別形成對(duì)應(yīng)的酶-抑制劑復(fù)合物EmetI和EoxyI，而且還能和酶-底物復(fù)合物EmetI和EoxyI分別形成對(duì)應(yīng)的酶-底物-抑制劑復(fù)合物EmetSI和EoxySI。同時(shí)，根據(jù)奧扎格雷對(duì)酪氨酸酶二酚酶的混合型抑制機(jī)理，這一過程可表示為：（如圖5所示）

其中E（Emet，Edeoxy和Eoxy）、D、I和P分別表示酶的三種形態(tài)、底物L(fēng)-DOPA、奧扎格雷和產(chǎn)物，EI、ES和ESI分別表示酶-抑制劑復(fù)合物、酶-底物復(fù)合物和酶-底物-抑制劑復(fù)合物。從酪氨酸酶角度分析，該酶存在兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，一個(gè)可與底物結(jié)合，另一個(gè)與抑制劑結(jié)合。當(dāng)?shù)孜锱c酶結(jié)合過程中，酶的天然構(gòu)象會(huì)發(fā)生一些形變，在這個(gè)變化過程中，酶的疏水性的“口袋”會(huì)變大。然后，酶和底物結(jié)合后，會(huì)形成一個(gè)新的疏水性的“口袋”，抑制劑奧扎格雷會(huì)嵌入這個(gè)“口袋”形成酶-底物-抑制劑復(fù)合物ESI。可以推斷出，酶和底物-抑制劑復(fù)合物ES容易形成并且結(jié)合力更強(qiáng)。而比較競(jìng)爭(zhēng)性和反競(jìng)爭(zhēng)性的強(qiáng)弱，則可通過單酚酶的測(cè)試來旁證，在單酚酶測(cè)活體系中，延滯現(xiàn)象很容易被觀察到。延滯期過后，反應(yīng)體系才達(dá)到穩(wěn)態(tài)。反推之，若奧扎格雷只與游離酶起作用，那樣不僅降低穩(wěn)態(tài)反應(yīng)速率而且延長延滯時(shí)間；若奧扎格雷只與酶-底物復(fù)合物ES起作用，奧扎格雷僅降低穩(wěn)態(tài)反應(yīng)速率，而且不會(huì)延長延滯時(shí)間，但是奧扎格雷不僅降低了穩(wěn)態(tài)反應(yīng)速率，而且延長了延滯時(shí)間，則說明競(jìng)爭(zhēng)性抑制效應(yīng)要強(qiáng)于反競(jìng)爭(zhēng)性抑制效應(yīng)。

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