奧扎格雷對酪氨酸酶的抑制機理

趙仕芝

摘 要：奧扎格雷不僅能抑制酪氨酸酶單酚酶的活性，而且能夠抑制酪氨酸酶二酚酶的活性。對單酚酶的抑制作用主要表現為抑制酶活，并且使得酶催化反應的延滯時間有明顯的延長，而對二酚酶的抑制作用，主要表現為抑制二酚酶酶活。同時，討論了酚氧化酶的催化氧化的機理：酶和底物結合后，會形成一個新的疏水性的“口袋”，抑制劑奧扎格雷會嵌入這個“口袋”，形成酶-底物-抑制劑復合物ESI。

關鍵詞：酪氨酸酶 奧扎格雷 單酚酶 二酚酶 抑制機理

中圖分類號：Q356.1 文獻標識碼：A 文章編號：1672-3791（2015）06（c）-0249-02

奧扎格雷（ozagrel）是一種新型抗血小板聚集藥，藥理研究表明，奧扎格雷能強力抑制TXA2合成酶的活性，從而抑制血小板聚集，同時提高前列環素PGI2的濃度，擴張血管，增加血流量，有效抑制腦血栓的形成，使已形成的血栓靠血液平衡關系的打破而被自行溶解，達到治療腦梗塞之功效。該文研究了奧扎格雷對蘑菇酪氨酸酶的抑制動力學。該研究結果為進一步的設計高效酪氨酸酶抑制劑奠定理論基礎，并為奧扎格雷及其衍生物作為食品防腐劑、果蔬保鮮劑以及美白化妝品的添加劑闡明了它們作用的酶學機理，為新型高效酪氨酸酶抑制劑的開發提供了新的分子模板。

1 實驗方法

1.1 酪氨酸酶活力測定

酪氨酸酶單酚酶活力測定：1.5mmol/LL-酪氨酸為底物，在pH6.8的磷酸鹽緩沖液中，30℃恒溫10分鐘，加入不同濃度的奧扎格雷溶液和酶溶液，在475nm波長下測定吸光度OD值。

酪氨酸酶二酚酶活力測定：1.0mmol/LL-DOPA為底物，在pH 6.8的磷酸鹽緩沖液中，30℃恒溫10分鐘，加入不同濃度的奧扎格雷溶液和酪氨酸酶溶液，在475nm波長下測定吸光度OD值。

2 結果與討論

2.1 奧扎格雷對酪氨酸酶單酚酶的影響

如圖1所示，奧扎格雷具有抑制蘑菇酪氨酸酶單酚酶酶活。測定不同濃度的奧扎格雷濃度對酪氨酸酶單酚酶作用的進程曲線，曲線1-5分別表示奧扎格雷在測酶活體系中的濃度為0、10、20、30和40mol/L。圖1結果表明，奧扎格雷能延長酶反應的延滯時間（曲線的直線部分交于X軸的值），并隨著奧扎格雷濃度的增大而延長。在相同反應時間下，反應體系的吸光度值隨著奧扎格雷濃度的增大而下降，說明奧扎格雷對酪氨酸酶的單酚酶活性有抑制作用。延滯期過后，酶催化體系逐漸達到了穩態（曲線的直線部分）。相對抑制率達到50%的奧扎格雷濃度（IC50）為1.35mmol/L。

2.2 奧扎格雷對酪氨酸酶二酚酶的影響

以L-DOPA為底物測定酪氨酸酶二酚酶酶活，反應進程曲線如圖2 （曲線0-5）。在測活條件體系中，加入酶液后，反應迅速進入穩態，產物與時間呈線性遞增，直線部分為酶催化底物反應級數為一級反應，隨著時間的延長，酶受到奧扎格雷的抑制，導致酶活下降，從而反應級數逐漸的由一級反應轉變為零級反應。在不同的奧扎格雷濃度條件下，隨著奧扎格雷濃度的增加，一級反應區域 （曲線直線部分） 的斜率逐漸減小，即奧扎格雷對酪氨酸酶二酚酶酶活的抑制程度增大。

2.3 催化機理

在氧氣存在條件下，酪氨酸酶的基本功能有兩個：作為單酚酶羥基化單酚生成鄰二酚（圖3）；作為雙酚酶氧化鄰二酚生成醌（圖4）。該酶具有包含兩個銅離子位點的活性中心，并與不同數目的氧原子配位結合具有三種不同狀態，分別為氧化態Eoxy，還原態Emet和脫氧態Edeoxy。氧化態Eoxy兼具單酚酶和二酚酶的活性；還原態Emet具有二酚酶的活性，不具有單酚酶活性，但是和單酚底物具有親和作用，所以還原態Emet是延滯效應產生的原因；脫氧態Edeoxy的作用是只能結合氧。所以，酪氨酸酶催化單酚類底物都是從Eoxy開始，Emet和Edeoxy均不與單酚類底物反應，Eoxy和Emet兩者都可以催化多酚類底物。

奧扎格雷能夠延長單酚酶的延滯時間，降低單酚酶和二酚酶的穩態速率，說明奧扎格雷能夠可逆的抑制酪氨酸酶并阻止多巴色素的生成，進而能夠遏制黑色素的生成。并且，對于二酚酶體系而言，奧扎格雷不僅能和還原態酶Emet和氧化態酶Eoxy結合分別形成對應的酶-抑制劑復合物EmetI和EoxyI，而且還能和酶-底物復合物EmetI和EoxyI分別形成對應的酶-底物-抑制劑復合物EmetSI和EoxySI。同時，根據奧扎格雷對酪氨酸酶二酚酶的混合型抑制機理，這一過程可表示為：（如圖5所示）

其中E（Emet，Edeoxy和Eoxy）、D、I和P分別表示酶的三種形態、底物L-DOPA、奧扎格雷和產物，EI、ES和ESI分別表示酶-抑制劑復合物、酶-底物復合物和酶-底物-抑制劑復合物。從酪氨酸酶角度分析，該酶存在兩個結合位點，一個可與底物結合，另一個與抑制劑結合。當底物與酶結合過程中，酶的天然構象會發生一些形變，在這個變化過程中，酶的疏水性的“口袋”會變大。然后，酶和底物結合后，會形成一個新的疏水性的“口袋”，抑制劑奧扎格雷會嵌入這個“口袋”形成酶-底物-抑制劑復合物ESI。可以推斷出，酶和底物-抑制劑復合物ES容易形成并且結合力更強。而比較競爭性和反競爭性的強弱，則可通過單酚酶的測試來旁證，在單酚酶測活體系中，延滯現象很容易被觀察到。延滯期過后，反應體系才達到穩態。反推之，若奧扎格雷只與游離酶起作用，那樣不僅降低穩態反應速率而且延長延滯時間；若奧扎格雷只與酶-底物復合物ES起作用，奧扎格雷僅降低穩態反應速率，而且不會延長延滯時間，但是奧扎格雷不僅降低了穩態反應速率，而且延長了延滯時間，則說明競爭性抑制效應要強于反競爭性抑制效應。

參考文獻

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