L—半胱氨酸對酪氨酸酶的抑制酪氨酸酶催化動力學

方慶秋

摘 要：L-半胱氨酸對酪氨酸酶活性有抑制作用，隨著L-半胱氨酸濃度的增加而酶活不斷受到抑制，并且延滯時間也相應延長。相對穩態酶活力則隨著L-半胱氨酸濃度的增大而下降。同時，對酪氨酸酶催化反應的影響及作用動力學機理進行了研究，分析延滯時間產生的根本原因，提出了酪氨酸酶的單酚酶將醌轉化為多巴黑色素的非酶反應偶聯的反應機理，研究其對酪氨酸酶催化反應的影響及作用動力學機理，為酪氨酸酶抑制劑的設計提供分子模板。

關鍵詞：酪氨酸酶 L-半胱氨酸 單酚酶 二酚酶 抑制 動力學

中圖分類號：Q356.1 文獻標識碼：A 文章編號：1672-3791（2015）06（c）-0116-02

酪氨酸酶是合成黑色素的關鍵酶，是白癜風免疫的重要抗原。最近發現的白癜風患者血清中的酪氨酸酶抗體和白癜風密切相關。可以使皮膚顏色通過抑制酪氨酸酶的活性，以防止皮膚黑色素的形成，即皮膚脫色劑。將某些酪氨酸酶抑制劑應用于美白化妝品。因此，尋找有效的和人體有無不良反應的酪氨酸酶抑制劑已成為醫藥和化妝品行業的研究和發展趨勢。該文以L-半胱氨酸作為效應物，研究其對酪氨酸酶催化反應的影響及作用動力學機理，為酪氨酸酶抑制劑的分子設計的實際應用提供依據。

1 實驗方法

1.1 酪氨酸酶活力測定

酪氨酸酶單酚酶活力測定：1.5mmol/LL-酪氨酸為底物，在pH 6.8的磷酸鹽緩沖液中，30℃恒溫10分鐘，加入不同濃度的L-半胱氨酸溶液和酶溶液，在475nm波長下測定吸光度OD值。

酪氨酸酶二酚酶活力測定：1.0 mmol/LL-DOPA為底物，在pH 6.8的磷酸鹽緩沖液中，30℃恒溫10分鐘，加入不同濃度的L-半胱氨酸溶液和酪氨酸酶溶液，在475nm波長下測定吸光度OD值。

2 結果與討論

2.1 L-半胱氨酸對酪氨酸酶單酚酶的影響

圖1可知，隨著體系中L-半胱氨酸濃度的增加，抑制單酚酶酶活的能力不斷增加。同時，增加L-半胱氨酸濃度能延長單酚酶反應的遲滯時間。當測活體系中不含L-半胱氨酸時，酶反應的延滯時間僅為121秒，但當L-半胱氨酸濃度為30μmol/L時，延滯時間540秒。使酶活力下降50%的L-半胱氨酸濃度（IC50）約為20.3μmol/L。

2.2 L-半胱氨酸對酪氨酸酶二酚酶的影響

圖2可知，隨著體系中L-半胱氨酸濃度的增加，抑制二酚酶酶活的能力不斷增加，導致酶活力下降一半所需的L-半胱氨酸濃度（IC50）為52.0μmol/L。加入L-半胱氨酸后也出現了延滯效應，而當體系中不含L-半胱氨酸時，不存在延滯現象，但當體系中加入L-半胱氨酸后，延滯現象開始出現，并且延滯時間隨著L-半胱氨酸濃度的增加而延長，當L-半胱氨酸濃度為100μmol/L時，延滯時間達到了284秒。

2.2 催化動力學模型

由圖1和圖2可知，從協同效應出發，提出了酪氨酸酶的單酚酶將醌轉化為多巴黑色素的非酶反應偶聯的反應機理（如圖3）。

圖3中，T為單酚；D為二酚；QH和Q分別是鄰半醌和鄰醌；L和DC分別是無色和黑色多巴色素；Emet和Edeoxy分別是活性位點帶Cu22+的氧化型酪氨酸酶和帶Cu2+的還原型酪氨酸酶；Eoxy是氧化酪氨酸酶；kapp為表觀速率常數。

對單酚作用的酪氨酸酶反應體系通過：1、酪氨酸酶的Emet轉變為Eoxy態；2、由QH生產二酚和多巴黑色素；3、由Eoxy態返回Emet態等過程而達到穩態。這一過程中，消耗單酚，生成二酚和多巴黑色素，根據由酪氨酸生物合成黑色素的實驗測定和計算機模擬得到：

（式1）

式中，和分別為單酚和二酚的最大穩態催化速率，即

，分別為單酚和二酚的Michaelis常數，即

（式2）

（式3）

式中，，

，，為穩態時二酚的濃度，為t=0時的單酚濃度。

根據實驗測定F，和上述實驗結果，可以求出從單酚或二酚生成的DC的穩態速率，，和。單酚生成DC的速率的方程是

（式4）

式中，

為t =0時的O2濃度若寫成表觀Michaelis方程，有

（式5）

這里的：

（式6）

（式7）

應注意的是，和都是表觀值，其真實值由氧氣濃度時的極限值求出。

對于Emet單純氧化二酚的反應機理，多巴黑色素的穩態積累速率是

（式8）

式中，

類似單酚氧化，式1-8也可以改寫成為

（式9）

式中，表觀，分別是

（式10）

（式11）

根據對DoxyD和EoxyT的穩態方程和上述動力學分析，有

（式12）

式中，

（式13）

當飽和時，則式1-11變成

（式14）

由反應機理可以看出，單酚濃度升高，非活化態的Emet被單酚進一步飽和，k2所制約的Emet態轉化為Edeoxy態的過程受到阻止，使得酶催化反應生產產物時間滯后，這就是延滯時間產生的根本原因。

參考文獻

[1] 蔡小玲，郭勇.新型皮膚美白劑的研究進展[J].環境與健康雜志，2003，20（5）： 313-314.

[2] 江志潔，朱育新，吳奇英，等.黑色素形成機理的新概念及復合美白劑的應用[J].日用化學工業，1998（4）：3-5.

[3] 汪昌國，金抒，李華山.皮膚美白劑進展[J].日用化學工業，2002，32（4）：56-60.

[4] 丁大鵬，馬文麗，鄭文嶺.酪氨酸酶抑制劑的研究進展[J].實用醫學雜志，2005， 21（12）：1364-1366.