一株海參來源的鏈格孢菌（Alternaria sp.）次級代謝產物的研究①

齊君++夏雪奎++劉新++袁文鵬++張永剛++賈愛榮++劉昌衡

摘 要：目的：對一株海參來源的鏈格孢屬真菌 （Alternaria sp.） 的次級代謝產物進行研究。方法：利用大米培養基對該菌進行發酵培養，通過薄層層析、柱層析、高效液相等分離手段，從鏈格孢屬真菌 （Alternaria sp.） 的乙酸乙酯提取物中分離獲得4個化合物。結果：利用質譜和核磁共振等現代波譜分析方法，依次鑒定為：麥角甾-4，6，8（14），22-四烯-3-酮（1），麥角甾-6β-羥基-4，7，22-三烯-3-酮（2），Alternariol（3）和Alternariol methyl ether（4）。

關鍵詞：海參來源真菌 Alternaria sp. 次級代謝產物

中圖分類號：R284.1 文獻標識碼：A 文章編號：1674-098X（2015）07（a）-0002-02

海參屬于海洋低等無脊椎動物中的棘皮動物門（Echinodermata）海參綱（Holothurioidea），是一種名貴的海洋動物，其營養豐富，是典型的高蛋白、低脂肪食物，其中的海參黏多糖、海參素、海參皂苷、氨基酸、多肽等活性成分，具有提高機體免疫力、抗疲勞、抗衰老、抗腫瘤等多種生理功能[1]。海參共附生微生物與其長期共存，共同抵御海洋特殊的生態環境，在生態系統的進化過程中與海參之間形成了良好的共生關系，能夠產生化學結構多樣、生物活性顯著的次級代謝產物，在活性天然產物的研究中有著巨大潛力[2-3]。本課題組已經從海參來源的真菌中發現了結構新穎的、具有細胞毒活性的二萜類化合物，具有抑制血管生成活性的苯并呋喃類化合物，以及具有多種生物活性的聚酮類化合物[4-6]。本研究對一株海參來源的鏈格孢屬真菌 （Alternaria sp.） HS-7的次級代謝產物進行了研究，通過薄層層析、柱層析、高效液相等分離手段，分離獲得4個化合物，經質譜和核磁共振等現代波譜分析，鑒定為：麥角甾-4，6，8（14），22-四烯-3-酮（1），麥角甾-6β-羥基-4，7，22-三烯-3-酮（2），Alternariol（3）和Alternariol methyl ether（4）。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

SW-CJ-1FD型超凈工作臺，蘇州安泰空氣技術有限公司；THZ-C型恒溫震蕩培養箱，江蘇太倉市實驗設備廠；Waters 高效液相色譜系統（美國Waters公司）；安捷倫QTOF 6530液質聯用儀；超導核磁共振儀 INOVA；石油醚，乙酸乙酯，二氯甲烷等為分析純，甲醇為色譜純（天津化學試劑廠）；柱層析硅膠（200目～300目），薄層硅膠GF254（青島海洋化工廠）；Sephadex LH-20。

1.2 菌種來源

菌株HS-7采集自威海成山頭海域的海參表皮分離得到，目前保存在山東省科學院生物研究所食品生物技術研究室。

1.3 方法

1.3.1 菌株的分離

將海參用無菌水清洗3次去除表面泥沙后，在海參各個部位分別切取小塊，然后用組織切片法和組織勻漿法進行共附生微生物的分離。放入28℃培養箱中倒置培養，采用平板劃線法挑取單菌落將其轉接到另一新的平板上，進行反復的劃線，獲得純的菌株。

1.3.2 菌株的發酵

從原始保藏菌種管中轉接到平板進行復活，確定菌株純化后，將菌種接取適量到 PDA液體培養基中，搖床培養2～3天，制備種子培養基。取種子培養液接入到大米培養基（120g/200mL海水，121℃，20min 高溫滅菌），發酵20瓶，在室溫下培養28天。

1.3.3 浸膏的制備和分離純化

發酵28天后，用3倍體積的乙酸乙酯浸泡提取大米培養基發酵物，減壓濃縮得到乙酸乙酯相浸膏（4.5g）。乙酸乙酯相浸膏經反復的正相硅膠柱層析、凝膠柱層析以及半制備HPLC等方法分離得到4個化合物。

2 結果與討論

化合物1易溶于氯仿，1HNMR譜圖顯示甾體化合物的特征，1HNMR（CDCl3， 400MHz）δ：6.61（1H，d，J=9.6Hz，H-7）， 6.04（1H，d，J=9.6Hz，H-6），5.74（1H， s，H-4），5.23（2H，m，H-22，H-23），1.06

（3H，d，J=6.8Hz，H-21），1.00（3H， s，H-19），0.96（3H，s，H-18），0.93（3H，d，J=6.8Hz，

H-28），0.85（3H，d，J=6.8Hz，H-27）， 0.83（3H，d，J=6.8Hz，H-26）。通過與文獻數據[7]的比較確定其結構為麥角甾-4，6，8 （14），22-四烯-3-酮。

化合物2：1HNMR（CDCl3，600MHz） δ：6.12（1H，d，J=2.2Hz，H-4），5.14-5.25 （3H，overlapped，H-7，H-22andH-23），

4.97（1H，brs，H-6），1.18（3H，s，H-19），

1.03（3H，d，J=6.6Hz，H-21），0.92（3H，

d，J=6.6Hz，H-28），0.84（3H，d，J=6.6Hz，

H-27），0.82（3H，d，J=6.6Hz，H-26）， 0.61（3H，s，H-18）。通過與文獻數據[8]的比較確定其結構為麥角甾-6β-羥基-4，7， 22-三烯-3-酮。

化合物3：1HNMR（DMSO，600MHz）δ：11.77（1H，s，2-OH），11.09（1H，brs，

4-OH），10.42（1H，brs，10-OH），7.26（1H，d，

J=1.8Hz，H-5），6.72（1H，d，J=2.4Hz，H-7），endprint

6.65（1H，d，J=2.4Hz，H-9），6.38（1H，d，J

=1.8Hz，-H-3），2.71（3H，s，8-Me）；13CNMR（DMSO，150MHz）δ：165.9（C，C-13），

165.1（C，C-4），164.5（C，C-2），158.9（C，C

-10），153.0（C，C-12），138.7（C，C-8），138.5

（C，C-6），118.0（C，C-11），109.4（CH，C-7），

104.7（CH，C-9），102.0（CH，C-5），101.3（C，

C-1），97.8（CH，C-3），25.6（CH3，8-Me）；ESIMS[M-H]-m/z257.2。經過與文獻數據[9-10]比對，確定化合物為Alternariol。

化合物4：1HNMR（DMSO，600MHz）δ：7.14（1H，d，J=1.8Hz，H-5），6.65（1H，

d，J=1.8Hz，H-7），6.54（1H，d，J=1.8Hz，

H-9），6.52（1H，d，J=1.8Hz，H-3），3.89（3H，

s，4-OMe），2.70（3H，s，8-Me）；ESIMS [M-H]-m/z271.2。經過與文獻數據[9-10]比對，確定化合物為Alternariol methyl ether。

3 結論

通過對海參來源的鏈格孢屬真菌 （Alternariasp.） HS-7次級代謝產物的研究，得到4個次級代謝產物。分別為麥角甾-4，6，8（14），22-四烯-3-酮（1），麥角甾-6β-羥基-4，7，22-三烯-3-酮（2），Alternariol（3）和Alternariol methyl ether（4）。其中化合物1和2均為首次從海參來源的真菌中分離得到。研究已證實麥角甾酮具有利尿、抗腫瘤、免疫抑制、治療慢性腎臟病等多種生物活性[7]，為海洋藥物先導化合物的發現提供了新資源。海參共附生微生物的研究為深入開發海參資源奠定了基礎，提供了新思路。

參考文獻

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[9] 楊志鈞，殷瑜，王志強，等.一株馬兜鈴內生真菌 Colletotrichum sp.代謝產物中細胞毒活性成分的研究[J].天然產物研究與開發，2012（24）：329.endprint