肝細胞肝癌中nectin-4蛋白的表達及其臨床意義

孫廣正，吳益磊，張海峰，李金海

（溫州醫科大學附屬第三醫院　普外科，浙江　溫州　325200）

肝細胞肝癌中nectin-4蛋白的表達及其臨床意義

孫廣正，吳益磊，張海峰，李金海

（溫州醫科大學附屬第三醫院普外科，浙江溫州325200）

目的：檢測肝細胞肝癌（HCC）組織中nectin-4蛋白表達水平，分析其與HCC臨床病理特征之間的關系。方法：采用免疫組織化學染色法檢測36例HCC組織及10例正常肝臟組織中的nectin-4蛋白的表達情況，采用x2檢驗分析nectin-4蛋白表達水平與HCC臨床病理特征之間的相關性。結果：HCC組織中nectin-4蛋白累積吸光度值為2.55±0.64，陽性區域面積值為8.96±1.57；正常肝臟組織組中nectin-4蛋白累積吸光度值為1.12±0.58，陽性區域面積值為5.12±1.43。HCC組織中nectin-4蛋白陽性表達量明顯高于正常肝臟組織，差異有統計學意義（P＜0.01）。nectin-4蛋白表達量在不同性別、年齡組間比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）；與組織病理分化程度（P＜0.01）、有無淋巴結轉移（P＜0.05）均明顯相關。結論：nectin-4蛋白在HCC組織中呈高表達，其表達水平與淋巴結轉移、惡性程度密切相關。

肝臟腫瘤；細胞黏附；nectin-4；免疫組織化學

肝細胞肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是臨床常見的惡性腫瘤之一，其不但發病率高，惡性程度高，預后差，且起病隱匿，早期診斷困難，術后易復發［1-2］，因此如何從分子水平對HCC進行早期診斷及預后的判斷是目前研究的重點。nectin-4蛋白是新近發現的免疫蛋白超家族中的一員，其不僅參與細胞的黏附、裂解，而且與多種腫瘤細胞的發生、發展有著密切聯系［3］。本研究通過檢測HCC組織及正常肝臟組織中nectin-4蛋白表達情況，并分析相關臨床病理資料，探討nectin-4蛋白在HCC發生、發展中的作用。

1　資料和方法

1.1一般資料 收集自2004年8月至2014年8月間在溫州醫科大學附屬第三醫院住院行手術治療的HCC患者的肝癌組織石蠟標本36例，其中男20例，女l6例，年齡35～77歲，平均56.2歲。收集同期因外傷致肝臟破裂接受手術的患者（無肝炎及肝硬化等疾病）的肝臟石蠟標本l0例，其中男6例，女4例，年齡19～65歲，平均40.2歲。所有病理切片均經兩名高年資病理專家會診確診。HCC患者術前均未行放、化療。HCC患者中l5例無淋巴結轉移，21例有淋巴結轉移；病理分化程度：高分化（G1）14例，中分化（G2）16例，低分化（G3）6例。

1.2 主要試劑 nectin-4羊抗人單克隆抗體購自美國Bio Basic公司，SP免疫組織化學試劑盒購自北京中杉金橋生物有限公司。

1.3免疫組織化學SP法檢測nectin-4蛋白的表達

石蠟切片脫蠟至水化，二甲苯、梯度乙醇（無水、95%、85%、75%）洗5 min，PBS沖洗3次，每次3 min。微波修復，高、中、低火各5 min，冷卻至室溫，PBS沖洗3次，每次3 min。室溫（18～30 ℃）下用3%雙氧水阻斷內源性過氧化物酶20 min。5% BSA孵育20 min；去除PBS，每張切片滴加一抗，4 ℃過夜，PBS沖洗3次，每次3 min。滴加二抗，室溫孵育20 min。滴加鏈霉菌抗生素-過氧化物酶溶液，室溫孵育20 min。自來水沖洗，蘇木素復染、鹽酸乙醇分化、溫水返藍。切片梯度乙醇脫水干燥、二甲苯透明，中性樹膠封片鏡檢。PBS代替一抗作陰性對照。

1.4結果判讀標準 胞漿著色呈棕黃色提示nectin-4蛋白表達陽性。采用彩色圖像分析系統（Leica Biosystems 5.0，美國徠卡公司）對呈現圖像進行分析：在HIS顏色模式下選中染色陽性區域，過濾背景干擾，測定累積吸光度（integral opticaldenisity，IOD）值及陽性區域面積（Area）值。每張切片隨機選取5個完整而不重疊的高倍鏡視野（×400），測定每個視野下陽性區域的IOD值和Area值，以每例5個視野的IOD值和Area值的平均值作為該例的測量值［4］。

1.5統計學處理方法 采用SPSS17.0統計軟件行統計學處理。所得數據用±s表示，采用x2檢驗分析nectin-4蛋白表達水平與HCC臨床病理特征之間的相關性。P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1nectin-4蛋白在肝臟組織中的表達情況 在HCC組織中，nectin-4蛋白呈強陽性表達，在正常肝臟組織中少量陽性表達（見圖1）。nectin-4蛋白表達量為：HCC組，IOD值為2.55±0.64，Area值為8.96±1.57；正常肝臟組織組，IOD值為1.12±0.58，Area值為5.12±1.43。HCC組中nectin-4蛋白的陽性表達量顯著高于正常肝臟組織組（P＜0.05）。

2.2nectin-4蛋白的表達與臨床病理參數的關系

在HCC組織中，nectin-4蛋白的表達水平在不同性別、年齡組間的比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；而與有無淋巴結轉移（IOD：t=2.17，P＜0.05； Area：t=2.06，P＜0.05）、組織病理分化程度（IOD：F=13.52，P＜0.01；Area：F=7.49，P＜0.01）均明顯相關。見表1。

圖1　nectin-4蛋白在肝臟組織中的表達（SP，×400）

表1　HCC臨床特征與nectin-4蛋白的表達水平的關系

表1　HCC臨床特征與nectin-4蛋白的表達水平的關系

臨床病理參數　n　IOD　P　Area　P年齡（歲）＜55　12　2.51±0.68＞0.05 8.55±1.71＞0.05 ≥55　24　2.55±0.72　8.87±1.62性別男20　2.27±0.66＞0.05 8.44±2.11＞0.05 女16　2.19±0.68　8.32±1.98淋巴結轉移陰性　15　2.05±0.54＜0.05 9.13±1.44＜0.05陽性　21　2.73±0.68　12.37±1.51病理分級G1　14　1.55±0.37＜0.01 7.43±1.07＜0.01 G2　16　2.81±0.46　9.55±2.12 G3　6　3.53±0.83　12.12±1.47

3　討論

nectin-4蛋白是免疫球蛋白超家族中的一員，屬細胞黏附分子，介導細胞間以及細胞與細胞基質間黏附與交聯，已被證實在多種腫瘤細胞遷移、黏附、增殖過程中發揮重要作用［5］。人類的nectin-4蛋白多在胎盤組織中表達，以nectin-4蛋白為基礎的細胞黏附的破裂，是E-鈣黏蛋白介導的細胞黏附的裂解以及細胞分離的觸發器［6］。nectin-4蛋白作為一種新發現的腫瘤相關抗原，已被證實在乳腺癌、卵巢癌的侵襲、轉移過程中發揮作用，這提示其將來可能作為一種新的腫瘤標記物應用于臨床［7-8］。本研究通過免疫組織化學的方法對HCC組織及正常肝臟組織中的nectin-4蛋白的表達情況進行檢測，發現nectin-4蛋白在肝癌細胞的胞漿中集中表達，正常肝臟組織中表達量較少，說明nectin-4蛋白可能參與促進肝臟惡性腫瘤的發生、發展的病理生理過程。這與其在胰腺癌［4］、肺癌［9］中的研究結果一致。但具體機制目前尚不明確，也是我們下一步研究的重點。

本研究還發現，nectin-4蛋白的表達量與HCC患者的年齡及性別均無關（P＞0.05），但其表達量在有淋巴結轉移的HCC患者肝臟組織中顯著高于無淋巴轉移者（P＜0.05），且分化越差、惡性程度越高的腫瘤組織，其nectin-4蛋白的表達量就越高，說明nectin-4蛋白的強表達可能促進惡性腫瘤細胞的分裂、增殖及侵襲能力，惡化腫瘤的生物學行為，促進腫瘤的進展。其機制可能與nectin-4蛋白強表達，可明顯促進細胞中間連接體和緊密連接體形成的速度，從而加強惡性腫瘤細胞之間的黏附裂解能力有關［10-11］。Frenzke等［12］認為，nectin-4蛋白在以E-鈣黏蛋白為基礎的細胞黏附裂解及隨后的細胞分離過程中發揮主導作用，通過對nectin-4蛋白外功能區的溶蛋白裂解，可導致80×103的細胞片段或33×103的跨膜和胞內片段增殖、分裂。另有研究［13］證實，nectin-4蛋白還可通過促進細胞轉化從而促使惡性腫瘤細胞增殖、侵襲及轉移。

綜上所述，nectin-4蛋白參與了HCC的發生、發展過程，有可能作為HCC的早期診斷指標應用于臨床。進一步研究nectin-4蛋白參與HCC腫瘤細胞增殖、轉移等的機制可能為HCC的早期診斷、靶向治療及預后監測提供新的方向。

［1］Vasavada BB， Chan CL. Rapid fibrosis and significant histologic recurrence of hepatitis C after liver transplant is associated with higher tumor recurrence rates in hepatocellular carcinomas associated with hepatitis C virus-related liver disease: a single center retrospective analysis［J］. Exp Clin Transplant， 2015， 13（1）: 46-50.

［2］吳之浩. 低氧應激對人肝癌細胞AFP、VEGF、TIMP-1、MMP-9表達的影響［J］. 溫州醫學院學報， 2012， 42（1）： 41-43.

［3］Mollo MR， Antonini D， Mitchell K， et al. p63-dependent and independent mechanisms of nectin-1 and nectin-4 regulation in the epidermis［J］. Exp Dermatol， 2015， 24（2）: 114-119.

［4］史光軍， 張磊， 陳昊強， 等. Nectin-4在胰腺癌中的表達及其臨床意義［J］. 中華普通外科雜志， 2010， 25（12）： 999-1001.

［5］Mateo M， Navaratnarajah CK， Willenbring RC， et al. Different roles of the three loops forming the adhesive interface of nectin-4 in measles virus binding and cell entry， nectin-4 homodimerization， and heterodimerization with nectin-1［J］. J Virol， 2014， 88（24）: 14161-14167.

［6］Birch J， Juleff N， Heaton MP， et al. Characterization of ovine nectin-4， a novel pest despetits ruminants virus receptor［J］. J Virol， 2013， 87（8）: 4756-4761.

［7］Athanassiadou AM， Patsouris E， Tsipis A， et al. The significance of Survivin and nectin-4 expression in the prognosis of breast carcinoma［J］. Folia Histochem Cytobiol， 2011，49（1）: 26-33.

［8］張萍， 柴守輝， 高媛， 等. Nectin-4與卵巢癌的關系及其意義［J］. 中國婦幼保健雜志， 2010， 25（3 4）： 5095-5098.

［9］Takano A， Ishikawa N， Nishino R， et al. Identification of nectin-4 oncoprotein as a diagnostic and therapeutic target for lung cancer［J］. Cancer Res， 2009， 69（16）: 6694-6703.

［10］ Nabih ES， Abdel Motaleb FI， Salama FA. The diagnostic efficacy of nectin-4 expression in ovarian cancer patients［J］. Biomarkers， 2014， 19（6）: 498-450.

［11］ Fortugno P， Josselin E， Tsiakas K， et al. Nectin-4 mutations causing ectodermal dysplasia with syndactyly perturb the rac1 pathway and the kinetics of adherens junction formation［J］. J Invest Dermatol， 2014， 134（8）: 2146-2153.

［12］ Frenzke M， Sawatsky B， Wong XX， et al. Nectin-4-dependent measles virus spread to the cynomolgus monkey tracheal epithelium: role of infected immune cells infiltrating the lamina propria［J］. J Virol， 2013， 87（5）: 2526-2534.

［13］ Mollo MR， Antonini D， Mitchell K， et al. p63-dependent and independent mechanisms of nectin-1 and nectin-4 regulation in the epidermis［J］. Exp Dermatol， 2015， 24（2）: 114-119.

（本文編輯：丁敏嬌）

Expression of nectin-4 in hepatocellular carcinoma and its clinical significance

SUN Guangzheng， WU Yilei， ZHANG Haifeng， LI Jinhai. Department of General Surgery， the Third Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University， Wenzhou， 325200

Objective: To study the nectin-4 expressions in hepatocellular carcinoma （HCC） and its clinical significance. Methods: The nectin-4 expression in 36 pairs of HCC tissues， and 10 samples of normal liver tissues were detected with immunohistochemical techniques. The relations of nectin-4 expression with the clinicopathologic parameters were analyzed. Results: The IOD and area of nectin-4 were 2.55±0.64 and 8.96±1.57 in hepatocellular carcinoma tissues， which were significantly higher than those in the normal liver tissues （P＜0.01）. The expression of nectin-4 was not correlated with patients demographics （P＞0.05）， and the protein expression was correlated with histopathologic grade （P＜0.01） and lymph metastasis （P＜0.05）. Conclusion: The high expression of nectin-4 in hepatocellular carcinoma tissues suggests that its high expression may be correlated with the malignant degree of the carcinoma， nectin-4 can be considered as a reference index of differentiation， metastasis and prognosis in hepatocellular carcinoma.

hepatocellular neoplasms； cell adhesion； nectin-4； immunohistochemistry

R753.2

A DOI: 10.3969/j.issn.2095-9400.2015.12.007

2015-02-09

孫廣正（1973-），男，浙江瑞安人，副主任醫師。