降糖方案和循環內皮祖細胞數量的關系

張愛鳴，沈麗珍，厲釵微，高賽賽

（溫州市中西醫結合醫院，浙江 溫州 325000，1.內分泌代謝病科；2.檢驗科）

·臨 床 經 驗·

降糖方案和循環內皮祖細胞數量的關系

張愛鳴1，沈麗珍2，厲釵微1，高賽賽1

（溫州市中西醫結合醫院，浙江 溫州 325000，1.內分泌代謝病科；2.檢驗科）

目的：探討不同降糖方案對初發2型糖尿病患者循環內皮祖細胞（EPCs）數量的影響。方法：通過納入標準和排除標準，選取初發2型糖尿病住院患者，共45例，記錄其年齡、性別、身高、體質量、腹圍并計算體質量指數（BMI），同時檢測空腹血糖（FPG）、空腹胰島素（FINS）、餐后2 h血糖（PPG）、糖化血紅蛋白（HbA1c）、膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白（HDL）、低密度脂蛋白（LDL）等主要指標。根據降糖方案不同，將初發2型糖尿病患者隨機分為3組。A組（15例）：胰島素皮下泵（CSII，諾和銳針）治療2周后改為一日2次預混胰島素治療（優泌樂25針，一日2次）；B組（15例）：口服降糖藥物治療組（達美康緩釋片30～120 mg/d）；C組（15例）：一日2次預混胰島素治療組（優泌樂25針，一日2次）。測定一般臨床資料后，用流式細胞儀測定治療前、治療4周后的CD34和KDR雙標陽性EPCs水平，進行治療前后的組內比較與治療后3組之間的組間比較。結果：治療前，A、B、C 3組各項臨床指標及EPCs的數量水平相近（P＞0.05）。組內比較顯示各組經治療后，EPCs數量均明顯升高，差異有統計學意義（P＜0.05）。治療4周后，A、C 2組的EPCs數量水平明顯高于口服降糖藥B組（P＜0.05），而A組與C組的EPCs數量水平相當（P＞0.05）。同時多元線性回歸分析顯示：EPCs的數量與HbA1c呈負相關（R2=0.664，P＜0.05）。結論：對于初發2型糖尿病患者，首選胰島素強化治療方案，快速緩解“高糖毒性”的同時，能夠提高患者EPCs數量，從而可能進一步改善糖尿病引起的內皮功能障礙，對預防及延緩糖尿病慢性血管并發癥的發生與發展起著一定的作用。血糖水平直接影響了糖尿病患者的EPCs的數量，即HbA1c越高，其EPCs的數量越少。

循環內皮祖細胞；初發2型糖尿病；胰島素強化治療；口服降糖藥

糖尿病是由多種病因引起的，以慢性高血糖為特征的代謝紊亂綜合征。血管病變包括大血管與微血管病變是2型糖尿病患者的主要致死、致殘原因。血管內皮功能障礙是預測心血管疾病的重要標志［1］。循環內皮祖細胞（endothel ial progenitor cel l s，EPCs）是一個能直接反映內皮功能損傷的重要標志物［2］。已有研究［3-4］表明高糖可損害外周血EPCs的數量及功能。有研究［5-6］認為，EPCs的數量和功能是糖尿病周圍血管并發癥的標志。另有研究［7］表明，增加EPCs的數量與功能，具有改善內皮功能與預防心血管疾病的作用。調節EPCs的藥物治療和細胞療法均獲得一定療效［8］。針對EPCs的治療能預防甚至逆轉并發癥，可見EPCs在糖尿病的并發癥發病機制中占有一席之地，也是十分有前景的治療靶點。

本研究通過對初發2型糖尿病患者進行口服降糖藥、預混胰島素皮下注射和初始胰島素泵3種不同降糖方案的干預，研究其對患者EPCs的數量的影響，提出評估不同降糖方案對EPCs影響的理論依據，為進一步深入研究糖尿病血管并發癥的防治提供實驗基礎。

1 對象和方法

1.1 研究對象 選取2014年1月至2014年12月我院住院的新診斷2型糖尿病患者（符合l999年WHO糖尿病診斷及分型標準）45例，均無嚴重急、慢性并發癥，無肝腎功能不全及自身免疫性疾病，近2周均無上呼吸道、泌尿系或其他感染性疾病史。同時入組前至少3個月未使用降糖、降壓、調脂或抗氧化等藥物。排除標準：合并肝腎功能不全者；糖尿病相關抗體陽性者；合并糖尿病酮癥者；合并各種感染（消化道、泌尿系統、腸道感染）者；有外傷、骨折等應激情況者；孕婦；在外院曾應用降糖或其他藥物者；為避免影響循環EPCs數目，女性不在月經周期進行檢測。

1.2 檢測指標 入組時，記錄患者初診時年齡、性別、血壓、身高、體質量、腹圍、同時檢測空腹血糖（fast ing plasma glucose，FPG）、空腹胰島素（fast ing insu l in，FINS）、餐后2 h血糖（postprandial plasma glucose，PPG）、糖化血紅蛋白（glycated hemoglobin，HbA1c）、總膽固醇（total cholesterol，TC）、總甘油三酯（total t riglyceride，TG）、高密度脂蛋白（high density l ipoprotein，HDL）、低密度脂蛋白（low density l ipoprotein，LDL）等主要指標，計算體質量指數（body mass index，BMI）=體質量/身高2（kg/m2）。

1.3 治療方案 45例入組患者在二甲雙胍片1 g/d的基礎上，隨機分成3組，采用不同的降糖方案：A組（15例）：胰島素皮下泵（CSII，諾和銳針）治療2周后改為一日2次預混胰島素治療（優泌樂25針，一日2次）；B組（15例）：口服降糖藥物治療（達美康緩釋片30～120 mg/d）；C組（15例）：一日2次預混胰島素治療（優泌樂25針，一日2次）。胰島素泵來自美國美敦力公司712易泵。3種方案均根據血糖控制目標，調整劑量。以FPG≤7 mmol/L，PPG≤8 mmol/L，為血糖控制目標。其中B組有2例患者因藥物增加至最大量，血糖仍不能達標，改為胰島素治療并退出研究，另有A組2位患者4周后未來門診復診，失訪，退出研究。所有患者于治療前、治療4周時分別進行EPCs計數測定。進行治療前后的組內比較與治療4周后的組間兩兩比較。治療期間堅持飲食及運動治療，常規使用二甲雙胍，有血壓升高者統一應用“科素亞”降壓治療，不使用調脂和其他抗氧化藥物。

1.4 檢測方法 患者治療前、治療后4周時的標本均于空腹10 h后，清晨抽血檢測。FPG、血脂檢測均采用全自動生化分析儀測定。FINS檢測采用放射免疫分析法。HbAlc采用離子交換高效液相色譜分析法檢測。以上指標在治療后4周時再次檢測。

循環EPCs的計數［9-10］：于股動脈穿刺取外周血2 mL，乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝后，取100 μL加入異硫氰酸熒光素標記的鼠抗人CD34抗體（CD34-FITC）、CD14-PC5和藻紅蛋白標記的鼠抗人血管內皮細胞生長因子受體2抗體（KDR-PE，Becton Dickinson，美國）各20 μL。另取100 μL抗凝血分別加入異硫氰酸熒光素標記的抗小鼠IgG1抗體（MS IGG1-FITC，Becton Dickinson，BD，美國）10 μL，藻紅蛋白標記的抗小鼠IgG1抗體（MS IGG1-PE，Becton Dickinson，BD，美國）5 μL作為同型對照，室溫避光孵育20 min。加入紅細胞裂解液Opti lyse C lysing solution（Beckman coul ter，美國）0.5 mL，室溫裂解紅細胞15 min。于水平離心機以1 500 r/min離心5 min后，棄上清。分別加入2 mL磷酸鹽緩沖液（PBS）于上述液體中，1 500 r/min離心10 min后，棄上清。于上述液體中分別加入500 μL PBS混勻，24 h內應用流式細胞儀（FC500，Beckman coul ter，美國）檢測。外周血中的雙陽性細胞通過二維散點圖來分析，建立CD14和側向散射光散點圖（CD14-SSC），設出單個核細胞區。從單個核細胞門中建立CD34對側向散射光散點圖，并設出CD34+細胞區。在CD34+細胞門中建立CD34、KDR散點圖，并分析CD34+KDR+雙陽性細胞個數。每個標本均收集2× 105個細胞，這2×105個細胞中所含CD34+KDR+雙陽性細胞個數即為EPCs的數量。實驗電壓、閾值、補償等設置由同型對照來完成，所有實驗由同一個操作者完成。

1.5 統計學處理方法 采用SPSS 17.0統計學軟件。計量資料數據用表示，多組間的兩兩比較采用單因素方差分析；組內治療前后數據比較采用配對t檢驗；基線水平的各項指標與EPCs的關系采用多元線性回歸分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 3組患者基線情況及治療前后的比較 如表1所示，單因素方差分析結果顯示，3組患者的基礎臨床各項指標及治療前EPCs數量相近，差異無統計學意義（P＞0.05）。表2中組內配對t檢驗顯示，3組患者治療前后的FPG、PPG、EPCs數量均明顯改善，差異有統計學意義（P＜0.05）。

表1 入組病例基本臨床資料

表1 入組病例基本臨床資料

注：EPCs計數：個/2×105個細胞

項目　 A組（n=13）　 B組（n=13）　 C組（n=15）年齡（歲）　 48.38±12.55 51.62±9.62　 49.93±11.44性別（男/女） 8/5　 9/4　 9/6身高（cm）　163.69±6.16　164.54±6.16　167.47±8.50體質量（kg）　 66.31±13.12 65.61±10.86 71.26±8.88 BMI（kg/m2）　 24.82±3.34　 23.91±3.50　 25.33±3.23腹圍（cm）　 80.69±6.81　 78.85±10.70 81.4±7.64收縮壓（mmHg）127.62±14.43 128.15±14.90 135.67±15.34舒張壓（mmHg） 79.85±10.22 78.46±15.33 84.67±13.02 FPG（mmol/L）　 11.14±2.09　 10.45±1.36　 10.11±1.19 PPG（mmol/L）　 17.19±2.14　 16.64±2.57　 15.74±2.68 HbA1c（%）　 10.98±1.57　 10.03±1.49　 10.04±1.69 FINS（μIu/L） 14.72±3.05　 13.58±2.48　 14.40±2.20 TC（mmol/L）　 4.98±0.87　 5.15±0.91　 5.07±0.74 TG（mmol/L）　 1.94±1.35　 2.01±1.38　 2.40±1.50 HDL（mmol/L）　 1.25±0.42　 1.14±0.48　 1.20±0.45 LDL（mmol/L）　 3.80±0.54　 3.74±0.54　 3.54±0.70 EPCs計數　 24.03±5.33　 25.70±5.74　 28.15±7.78

2.2 各組間兩兩比較 對于3組治療4周后的EPCs計數的檢測結果進行單因素ANOVA分析結果顯示，與B組口服降糖藥治療組對比，A組初期胰島素泵治療組、C組預混胰島素治療組，在血糖控制相當的情況下，EPCs數量明顯增多，差異有統計學意義（P ＜0.05），見表2。而A、C 2組間比較顯示在治療4周時其EPCs的數量相當，差異無統計學意義（P＞0.05）。

2.3 基線水平的各項臨床因素指標與EPCs的多元線性回歸分析 以EPCs為因變量，以基線的各項臨床檢測指標為自變量，多元線性回歸分析結果如表3所示：EPCs數量與HbAlc呈負相關（R2=0.664，P＜0.05）。

3 討論

EPCs是1997年Asahara等［11］首先從人外周血中分離出，能在體內分化為內皮細胞，在血管損傷或組織缺血的情況下，EPCs可有效修復血管內皮損傷和參與血管新生。研究［6，12］發現，噻唑烷二酮類可增加2型糖尿病患者體外培養EPCs的數量。也有研究［13］表明西格列汀也能增加2型糖尿病患者的EPCs的數量，具有一定的心血管保護作用。體外研究［14］表明胰島素能夠增加培養基中EPCs，尤其是早期EPCs和單個核細胞的數量。國外研究［15］發現基礎胰島素均可增加2型糖尿病患者體外培養EPCs的數量。國內也有研究［16］顯示，短期CSII強化治療后，亦能恢復糖尿病患者EPCs，進而有助于防止和修復已損傷的血管病變。最近研究［17］說明對于初發糖尿病患者采取多因素的干預強化控制血糖可以明顯改善EPCs的數量與功能。對于初發糖尿病患者盡早短期注射胰島素強化治療除降低血糖外，是否還可以進一步提高EPCs，具有獨立于降糖之外的血管內皮保護作用，從而能夠更有效地預防糖尿病相關血管并發癥仍是一個懸而未決的問題。目前國內外比較不同降糖方案對EPCs數量與功能影響的研究非常有限。

表2 治療前后各組血糖及EPCs數量的變化

表2 治療前后各組血糖及EPCs數量的變化

與同組治療前比：aP＜0.05；與B組治療4周比：bP＜0.05

項目　A組（n=13）　B組（n=13）　C組（n=15）治療前　　治療4周　　治療前　　治療4周　　治療前　　治療4周FPG　11.14±2.09　 5.71±0.80ab　10.45±1.36　 5.62±0.65a　10.11±1.19　5.83±0.72abPPG　17.19±2.14　 7.71±0.90ab　16.64±2.57　 7.61±1.55a　15.74±2.68　6.88±1.53abEPCs　24.03±5.33　37.51±5.06ab　25.70±5.74　31.96±4.78a　28.15±7.78　36.65±5.69ab

表3 多元線性回歸分析結果a

本研究結果顯示，2型糖尿病患者的EPCs的數量與HbAlc存在明顯的線性相關（呈負相關），這與既往相關研究［18］相符。另外，從本研究可以看到，對于初診糖尿病患者，不管采用何種治療方案，治療4周后均能顯著增加患者EPCs的數量，此種改善可能依賴于血糖的降低，“高糖毒性”的解除。同時我們發現，采用胰島素強化治療組在4周后，其EPCs數量的增加更加明顯，優于口服降糖藥組，差異有統計學意義。故認為此作用是獨立于“高糖毒性”解除的療效。而預混胰島素治療組與短期胰島素皮下泵治療組相比，EPCs的數量影響差異無統計學意義，也就是前期2周的胰島素泵治療并沒有存在優勢，可能與時間太短有關。但長期應用胰島素泵治療，是否有優勢，尚待進一步觀察研究才能明確。

綜上所述，本研究結果表明在糖尿病初期盡早啟動胰島素治療，在明顯改善糖代謝紊亂的同時，能更好恢復糖尿病患者EPCs的數量，對于預防和延緩糖尿病相關的內皮細胞功能障礙可能存在潛在的獲益，從而能進一步地減少糖尿病相關的慢性血管并發癥。但本研究樣本量較小，對于以后的長期預后尚需進一步研究。

［1］ Urbich C，Dimmeler S. Endothelial progenitor cells：characterization and role in vascular biology［J］. Circ Res，2004，95（4）：343-353.

［2］ Hill JM，Zalos G，Halcox JP. et al. Circulating endothelial progenitor cells，vascular function，and cardiovascular risk ［J］. N Engl J Med，2003，348（7）：593-600.

［3］ 袁紅，陳君柱，王興祥. 高糖對外周血內皮祖細胞數量和功能的影響［J］. 解放軍醫學雜志，2004，29（9）：803-806.

［4］ 趙力，王海昌，尹濤，等. 高糖對內皮祖細胞功能的損害及胰島素的影響［J］. 中國病理生理雜志，2008，24（4）：688-691.

［5］ Fadini GP，Sartore S，A lbiero M，et al. Number and function of endothelial progenitor cells as a marker of severity for diabetic vasculopathy［J］. Arterioscler Thromb Vasc Biol，2006，26（9）：2140-2146.

［6］ Wang CH，Ting MK，Verma S，et al. Pioglitazone increases the numbers and improves the functional capacity of endothelial progenitor cells in patients w ith diabetes mellitus ［J］. Am Heart J，2006，152（6）：1051.e1-e8.

［7］ Kumar AH，Caplice NM. Clinical potential of adult vascular progenitor cells［J］.Arterioscler Thromb Vasc Biol，2010，30（6）：1080-1087.

［8］ Fadini GP，Avogaro A. Potential manipulation of endothelial progenitor cells in diabetes and its complications［J］. Diabetes Obes Metab，2010，12（7）：570-583.

［9］ Peichev M，Naiyer AJ，Pereira D，et al. Expression of VEGFR-2 and AC133 by circulating human CD34（+） cells identifies a population of functional endothelial precursors［J］. Blood，2000，95（3）：952-958.

［10］ Hristov M，Weber C. Endothelial progenitor cells：characterization，pathophysiology，and possible clinical relevance［J］. J Cell M ol M ed，2004，8（4）：498-508.

［11］ Asahara T，M urohara T，Sullivan A，et al. Isolation of putative progenitor endothelial cells for angiogenesis［J］. Science，1997，275（5302）：964-967.

［12］ Pistrosch F，Herbrig K，Oelschlaegel U，et al. PPARgamma-agonist rosiglitazone increases number and m igratory activity of cultured endothelial progenitor cells［J］. Atherosclerosis，2005，183（1）：163-167.

［13］ Fadini GP，Boscaro E，A lbiero M，et al. The oral dipeptidyl peptidase-4 inhibitor sitagliptin increases circulating endothelial progenitor cells in patients w ith type 2 diabetes：possible role of stromal-derived factor-1 alpha［J］. Diabetes Care，2010，33（7）：1607-1609.

［14］ Humpert PM，Djuric Z，Zeuge U，et al. Insulin stimulates the clonogenic potential of angiogenic endothelial progenitor cells by IGF-l receptor-dependent signaling［J］. Mol Med，2008，14 （5-6）：30l-308.

［15］ Fadini GP，de Kreutzenberg SV，Mariano V，et al. Optim ized glycaem ic control achieved w ith add-on basal insulin therapy im proves indexes of endothelial damage and regeneration in type 2 diabetic patients w ith macroangiopathy：a randomized crossover trial comparing detem ir versus glargine ［J］. Diabetes Obes Metab，2011，13（8）：718-725.

［16］ 楊吉鋒，陶松桔，張亞萍，等. 短期胰島素泵強化治療對初診T2DM患者循環內皮祖細胞水平的影響及其抗炎機制［J］. 中國臨床研究，2011，24（8）：666-668.

［17］ Reinhard H，Jacobsen PK，Lajer M，et al. M ultifactorial treatment increases endothelial progenitor cells in patients w ith type 2 diabetes［J］. Diabetologia，2010，53（10）：2129-2133.

［18］ Churdchom jan W，Kheolamai P，Manochantr S，et al. Comparison of endothelial progenitor cell function in type 2 diabetes w ith good and poor glycem ic control［J］. BMC Endocr Disord，2010，10：5.

（本文編輯：吳健敏）

Study on the relationship between hypoglycem ic schem e and the num ber of circulating endothelial progenitor cells

ZHANG Aiming1，SHEN Lizhen2，LI Chaiwei1，GAO Saisai1. 1.Department of Endocrinology and Metabolism，Wenzhou Hospital of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine，Wenzhou，325000；2.Department of Clinical Laboratory，Wenzhou Hospital of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine，Wenzhou，325000

Objective：To investigate the effects of different hypoglycemic programme on the infuence of the number of circulating endothelial progenitor cells （EPCs） in patients w ith primary type 2 diabetes. M ethods：Forty-fve new ly diagnosed type 2 diabetes hospitalized patients were selected through the inclusion and exclusion criteria. The age，gender，height，weight，waist circum ference and calculated body mass index （BM I） were recorded for each patient. The level of fasting blood glucose （FPG），fasting insulin （FINS），2 hour postprandial blood glucose （PPG），glycosylated hemoglobin （HbA1c），triglyceride （TG），cholesterol （TC），high density lipoprotein （HDL） and low density lipoprotein （LDL） were measured. The new ly diagnosed type 2 diabetes mellitus patients （mentioned above） were random ly divided into three groups according to the different hypoglycem ic treatment. group A （n=15）：patients were treated with twice per day of prem ixed insulin therapy （Humalog 25 pin） after 2 weeks of subcutaneous insulin pump therapy （CSII insulin aspart）. group B （n=15）：patients were treated w ith oral hypoglycemic drug （Diamicron MR 30-120 mg/d）； group C （n=15）：patients were treated with premixed insulin （Humalog 25 pin tw ice perday）. After determ ination of general clinical data，the level of EPCs labled w ith CD34 and KDR double positive before and after 4 w eeks of treatment were measured w ith f ow cytometry. The number of EPCs before and after treatment and three groups after 4 weeks treatment were compared to investigate the short-term effects of different hypoglycemic therapy effects of intensive treatment in new ly diagnosed type 2 diabetic patients on the number of EPCs. Results：The clinical indexes and the number of EPCs in the A，B，C three groups show ed no difference before treatment （P＞0.05）. However，treatment signif cantly increased the number of EPCs in A.C groups w as higher than B group after 4 weeks treatment. How ever no difference observed betw een A and C group. M eanw ile，the number of EPCs and HbA1c had obvious negative linear correlation through mulitip le linear regression analysis. Conclusion：A ltogether，these results suggest that the insulin strengthening treatment is better for new ly diagnosed patients w ith type 2 diabetes mellitus. This treatment can relief of “glucotoxicity” rapidly and increase the number of EPCs，which may alleviate the endothelial dysfunction induced by diabetes and may prevent or delay the diabetes chronic vascular complication incidence. Meanw ile，the level of blood glucose has a direct impact on the number of EPCs in patients of diabetes. Our result is consistant w ith published reported that the higher HbA1c usually accompany w ith the less the number of EPCs in diabetes.

circulating endothelial progenitor cells； new ly diagnosed type 2 diabetic； early intensive insulin therapy； oral hypoglycem ic drugs

R587.1

B DO I：10.3969/j.issn.2095-9400.2015.10.010

2015-01-31

溫州市科技局科研基金資助項目（Y20140088）。

張愛鳴（1975-），女，浙江樂清人，副主任醫師，碩士。