水稻OsCER4基因啟動子序列及表達分析

林曉林等

摘要：通過生物信息學方法對水稻（Oryza sativa L.）蠟質合成相關基因OsCER4啟動子序列和表達特性進行了分析；通過構建OsCER4啟動子驅動的GUS融合表達載體，分析了OsCER4基因的時空表達；并分別以200 mmol/L NaCl、100 μmol/L ABA和1.0% H2O2處理水稻幼苗，通過半定量RT-PCR分析逆境脅迫下OsCER4的表達模式。啟動子序列分析表明，OsCER4啟動子中包括大量根、莖、葉肉等特異表達位點以及與干旱、冷、鹽等多種逆境脅迫相關的調控序列。表達特征分析表明，OsCER4基因在愈傷組織、根、莖、葉中均有表達，在穎殼和子房中也有表達。NaCl和PEG等逆境脅迫下，OsCER4基因表達量在不同處理時間有所增加，H2O2脅迫下，OsCER4基因表達量有所下降。

關鍵詞：水稻（Oryza sativa L.）；OsCER4基因；啟動子；表達；逆境

中圖分類號：Q78 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）18-4607-06

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.18.056

植物在生長發育過程中，常常會受到干旱、鹽漬、低溫、病蟲害等非生物和生物脅迫因素的影響，其中，水分脅迫是環境脅迫中最普遍的逆境因子。干旱脅迫嚴重影響植物生長，增強植物抗旱性已成為植物育種的重要研究方向。在干旱逆境脅迫條件下，植物不僅可以通過細胞內的生理生化變化提高對干旱脅迫的耐性，如產生滲透調節物質脯氨酸以及增加抗氧化能力等。同時，植物還可以通過誘導干旱脅迫應答基因表達，產生大量特異蛋白，協同調節植物生理生化而適應外部逆境，提高對干旱的抗性。因此，剖析相關基因在植物逆境脅迫應答中的作用已成為植物分子生物學和作物抗旱研究的熱點。

所有植物的地上部分表皮細胞外都覆蓋著角質層，角質層由最外層的上表皮蠟質層和角質膜層組成，其主要功能是防止植物水分損失[1]，同時也是抵御外源物質滲入和微生物入侵的有效屏障[2]。多個與蠟質相關的基因已經在擬南芥（Arabidopsis thaliana）、水稻（Oryza sativa L.）等植物中被相繼發現[3-10]，烷類合成相關的蠟質基因CER1在干旱脅迫條件下表達量顯著增加[5]，而過表達CER1基因提高了植株抗逆性[6]。擬南芥角質層蠟質和角質合成的必需基因LACS1和LACS2發生突變增加了植株對干旱的敏感性[7]；水稻角質層蠟質合成相關基因OsGL1-1和OsGL1-2（又命名為WSL2）的突變導致植株葉表面蠟質明顯減少，增加了植株干旱敏感性，而過表達OsGL1-1基因提高了植株對干旱的抗性[8-10]。過表達苜蓿中克隆的轉錄基因WXP1能增加表皮蠟質的積累，減少水分的喪失，增加抗旱能力[11]，轉WXP1基因的擬南芥耐旱性同樣增加[12]。OsCER4基因與擬南芥CER1基因，水稻OsGL1-1基因和OsGL1-2基因高度同源，屬于脂肪醛脫羧酶（Fatty aldehyde decarbonylase）基因家族成員[13，14]。OsCER4基因（OsGL1-6）主要影響葉表面蠟質的合成，OsCER4基因（OsGL1-6）表達量的下降導致葉表面蠟質減少，干旱敏感性增加[15]。本研究通過生物信息學方法對水稻蠟質合成相關基因OsCER4（OsGL1-6）啟動子序列和表達特性進行分析，同時，對逆境脅迫下OsCER4基因（OsGL1-6）的表達模式進行研究，為闡明OsCER4（OsGL1-6）基因在逆境脅迫下的分子作用機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 水稻（Oryza sativa L.）品種中花11，由華南農業大學遺傳工程實驗室提供。

1.1.2 載體與菌株 pCAMBIA1300G，以pCAMBIA1300與pBI221聯合改建而成，在pCAMBIA1300的多克隆位點上插入了一段CaMV 35S啟動子-GUS-終止子的序列，由華南農業大學遺傳工程實驗室提供；大腸桿菌菌株為DH10B；農桿菌菌株為EHA105，由華南農業大學遺傳工程實驗室保存。

1.1.3 試劑 RNA抽提試劑盒TRIzol 購自 Invitrogen公司；反轉錄酶（AMV RTase）、RNase inhibitor、Taq DNA聚合酶和dNTP等購自寶生物工程（大連）有限公司；氯仿、無水乙醇等為國產分析純。

1.1.4 引物 OsCER4啟動子擴增引物為OsCER4Gpr（5′-AAAAGGATCCTAGAGGCCATGATAGCTAGC-3′）和OsCER4Gpf （5′-AAAAAAG

CTTGGTTTGGAGATACAATCTGTG-3′）；OsActI擴增引物為OsActI-R（5′-TCTGGGTCATCTTCTCACGA-3′）和OsActI-F（5′-CGTCTGCGATAATGGAACTG-3′）；OsCER4擴增引物為OsCER4-R（5′-TCGTCGTATGGCCGGAATC-3′）和OsCER4-F（5′-GTCATGCAGTTACAGCAGCA-3′）。

1.2 方法

1.2.1 生物信息學分析 應用PLACE（http：//www.dna.affrc.go.jp/PLACE/）對啟動子順式調控元件進行預測；應用RIFGP（http：//plantbiol.genetics.ac.cn/rice-Affy）對OsCER4表達的組織器官特異性進行分析。

1.2.2 OsCER4啟動子表達分析 以OsCER4Gpf、OsCER4Gpr為引物，以中花11基因組DNA為模板擴增蠟質合成相關基因OsCER4啟動子片段，PCR擴增反應程序： 94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，68 ℃延伸2 min，共7個循環；94 ℃變性30 s，65 ℃退火30 s，68 ℃延伸2 min，共28個循環；68 ℃延伸10 min。以OsCER4啟動子片段替代載體pCAMBIA 1 300中的CaMV35S啟動子，重新組裝的載體采用農桿菌介導方法轉入水稻中花11[16]。分別取轉化水稻的愈傷組織、根、莖、葉、穗子等材料放于固定液（50 mmol/L磷酸緩沖液、1% 甲醛、0.5% Triton-100、pH 7.0）中，抽真空10 min，固定45 min；棄去固定液，加入適量洗液[50 mmol/L 磷酸緩沖液、0.5% Triton-100、1 mmol/L K3Fe（CN）6，1 mmol/L K4Fe（CN）6·3H2O、pH 7.0]，抽真空5 min，洗3次；棄去洗液，加入染色液[1 mmol/L磷酸緩沖液、0.5% Triton-100、0.25 mg/mL X-Gluc、1 mmol/L K3Fe（CN）6、1 mmol/L K4Fe（CN）6·3H2O、pH 7.0]，抽真空15 min，置于37 ℃反應過夜；樣品以70%乙醇進行洗滌和保存，并在解剖鏡下進行觀察拍照。

1.2.3 逆境處理 參照Li等[17]方法進行，PEG、H2O2和NaCl的濃度分別為12%（M/V），1.0%（V/V），200 mmol/L。

1.2.4 RT-PCR分析 總RNA抽提參照李玲等[18]方法，逆轉錄反應參照Cristina等[19]方法。以OsActI為內參基因，以反轉錄得到的cDNA為模板，以OsCER4-R、OsCER4-F為引物進行PCR擴增，分析蠟質合成相關基因OsCER4的表達情況。PCR擴增反應體系：cDNA 1 μL、10×Buffer 2.5 μL、dNTPs（10 mmol/L）0.25 μL、上游引物（10 μmol/L）1 μL、下游引物（10 μmol/L）1 μL、Taq DNA聚合酶（5 U/μL）0.2 μL、ddH2O 19.05 μL。PCR擴增反應程序為：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，27個循環；72 ℃延伸10 min。

2 結果與分析

2.1 OsCER4基因啟動子的反式作用元件分析

應用植物啟動子及其反式元件分析在線數據庫PLACE（http：//www.dna.affrc.go.jp/PLACE/signalup.html）對OsCER4啟動子順式作用元件進行了預測，結果見表1。結果表明，OsCER4啟動子存在典型的TATA-box和啟動子的基本元件CAAT-box以及大量的組織特異表達核苷酸位點：29個葉肉特異表達的CACTFTPPCA1位點，22個莖特異表達的位點DOFCOREZM和CCA1ATLHCB1，38個根特異表達位點ROOTMOTIFTAPOX1，RHERPATEXPA7，RYREPEATBNNAPA和RAV1AAT；4個花器發育相關元件MYBPLANT和NTBBF1ARROLB。OsCER4啟動子也包括大量的與逆境相關的順式作用元件：早期應答脫水脅迫和ABA應答有關的順式作用元件ACGTABREMOTIFA2OSEM、ABRELATERD1、

ACGTATERD1、ANAERO1CONSENSUS、MYB1AT、MYBCORE、DPBFCOREDCDC3、CATATGGMSAUR、GADOWNAT、MYB1AT、MYCATRD22、MYCATERD1和WRKY71OS以及響應高鹽、冷、傷害、病原菌等生物和非生物脅迫的順式元件GT1GMSCAM4、MYCCONSENSUSAT、BIHD1OS、MYBPZM、RAV1AA

T、OSE2ROOTNODULE、WBBOXPCWRKY1、MYBST

1、ELRECOREPCRP1和WBOXNTERF3等；還有響應Ca2+信號、氧化脅迫以及銅離子脅迫相關的順式作用元件CURECORECR和ABRERATCAL。同時，還存在外源激素信號分子生長素、細胞分裂素、水楊酸相關順式作用元件SURECOREATSULTR11、ARR1AT、CPBCSPOR、WBOXATNPR1和ASF1MOT

IFCAMV等。除了脅迫相關順式作用元件，還發現與儲藏蛋白質表達相關的調控元件2SSEEDPROTBANAPA和SEF4MOTIFGM7S；光誘導順式作用元件GATABOX、REALPHALGLHCB21和IBOXCORE/SORLIP1AT以及糖應答元件CGACGOSAMY3、WBOXHVISO1、YRIMIDINEBOXOSRAMY1A、TATC

CAYMOTIFOSRAMY3D和MYBGAHV等。通過啟動子順式元件網站的分析預測，水稻蠟質合成相關基因OsCER4啟動子具有葉、根、莖等組織特異表達的特性，且存在多個響應生物和非生物逆境脅迫的元件。

2.2 OsCER4基因的表達分析

通過水稻基因組芯片表達數據庫（http：//plantbiol.genetics.ac.cn/rice-Affy）分析表明，OsCER4基因主要在幼苗葉、幼苗、子房和胚中表達，OsCER4基因可能在葉或種子發育中起作用（表2）。

2.3 OsCER4啟動子的表達分析

從中花11基因組中用引物OsCER4Gpr和OsCER4Gpf擴增OsCER4基因的啟動子OsCER4P。結果表明，獲得與預期大小一致的1 946 bp特異片段（圖1a）。用Hind Ⅲ和BamHⅠ雙酶切將OsCER4P啟動子片段克隆到pCAMBIA1300G載體中，用OsCER4基因的啟動子CER4P替代載體中的35S啟動子，然后抽提質粒DNA進行酶切鑒定，結果如圖1b所示。將質粒DNA酶切鑒定的菌液送至Invitrogen公司測序，測序正確的菌株抽取質粒轉化農桿菌。同時，本研究通過對農桿菌的GUS染色來鑒定啟動子啟動GUS活性表達的能力以及進一步確認農桿菌的陽性克隆。結果（圖1c）表明，啟動子具有啟動GUS活性表達的能力。通過農桿菌介導法將OsCER4P：：GUS載體轉化水稻，轉化植株經陽性植株鑒定之后，取其愈傷組織、根、莖、葉及小穗進行GUS染色，通過GUS組織化學染色方法來分析OsCER4基因啟動子表達的特異性。GUS染色分析表明，在愈傷組織、根、莖、葉中均能檢測到GUS活性（圖2）。在穎殼和子房中也有GUS活性表達，說明OsCER4的表達有組織特異性，可能與營養器官和種子的發育有關。

2.4 逆境脅迫下OsCER4的表達分析

為考察水稻蠟質合成相關基因OsCER4對逆境的響應，本研究采用半定量RT-PCR的方法分析不同逆境處理下幼苗中OsCER4表達變化。結果（圖3）表明，NaCl處理下對OsCER4而言，在處理6 h之內，其表達量下降，當處理時間達12 h時，表達量有所增加；PEG處理下，OsCER4表達量在處理30 min 后開始有所增加，并維持在較高水平，36 h時略有下降；H2O2處理下，OsCER4表達量在處理30 min 時變化不明顯，3 h時表達量開始下降。

3 小結與討論

植物基因啟動子控制著基因在特定的組織、特定的發育階段以及一定的環境條件下表達。基因所表現的時空特異性受到該基因啟動子區域內各種順式作用元件與不同反式作用因子之間相互作用的協調控制。啟動子序列分析表明，OsCER4基因啟動子具有啟動子常有的相應調控元件以及下游組織特異性表達必需的核苷酸序列，包括TATA-box、CAAT-box等。啟動子還含有大量的組織特異表達順式作用元件：葉肉、莖、根、花器發育（MYBPLANT）以及微管組織發育（NTBBF1ARROLB）相關的特異順式表達元件，說明OsCER4基因可能與營養器官和微管組織以及種子的發育有關。通過水稻基因組芯片表達數據庫分析表明，OsCER4基因在幼苗、幼葉、子房和胚中表達量較高。而OsCER4啟動子驅動的GUS融合表達分析表明，OsCER4基因啟動子在根、莖、葉、葉枕、穎殼、子房等均有表達活性，在花藥中幾乎沒有表達活性，進一步說明OsCER4基因可能與營養器官和種子的發育有關。在對OsCER4基因（OsGL1-6）的前期研究中發現，OsCER4基因表達部位集中于維管束區域[15]，這一結果與本研究對啟動子區域的組織特異表達順式作用元件分析一致。說明OsCER4基因啟動子序列上一系列的順式元件決定了其組織器官的表達。

植物組織特異表達的啟動子中存在著不同的結構域，通過這些結構域的協同作用調節著啟動子不同的表達模式。OsCER4基因啟動子序列中還有大量干旱、高鹽、病原菌、冷等逆境脅迫應答相關順式作用元件，說明OsCER4基因啟動子調控的下游基因與植物逆境應答反應相關。本研究應用RT-PCR技術研究該基因在PEG、高鹽和H2O2等處理下的表達模式，結果表明，在高鹽和干旱處理條件下，OsCER4基因表達量均有所上調。植物表皮蠟質層在植物生長發育、適應外界環境方面具有重要作用，植物表皮蠟質層的增加常常受環境逆境的誘導。玉米、擬南芥等植物蠟質合成中的關鍵基因在mRNA水平上的表達受干旱、鹽逆境處理調節[20]。擬南芥在150 mmol/L NaCl處理下葉蠟質總量增加[5]。水稻幼苗在NaCl、H2O2、ABA等逆境脅迫下，OsGL1-5基因表達均受到誘導[20]。逆境處理誘導蠟質合成相關基因的表達以及增加蠟質的積累可能是植物適應環境的一種機制。蠟質合成相關基因在不同逆境處理下誘導表達的情況不一樣，本試驗發現H2O2處理下，OsCER4基因表達量下降，而在分析OsGL1-5基因的逆境響應時發現其在H2O2處理下的表達量增加[21]。高國賦等[22]的研究也發現不同蠟質合成相關基因對不同脅迫響應存在差異，前期研究高溫和低溫對蠟質基因表達的影響時也有同樣發現[16]。

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