二袖套法大鼠原位肝移植手術技巧探討

張　杰, 都　敏, 鮑　興, 戴璟瑜, 閻玉礦, 彭海峰

（1. 深圳市第九人民醫院, 深圳　518116；　2. 深圳市龍崗區人民醫院, 深圳　518172）

·經驗交流·

二袖套法大鼠原位肝移植手術技巧探討

張杰1, 都敏1, 鮑興1, 戴璟瑜1, 閻玉礦1, 彭海峰2

（1. 深圳市第九人民醫院, 深圳518116；2. 深圳市龍崗區人民醫院, 深圳518172）

目的探討二袖套法建立大鼠原位肝移植模型的外科技巧。方法在Kamada二袖套法基礎上, 對供體靜脈處理, 受體門靜脈、肝上下腔的處理等手術方法作了改進。結果共建立50例大鼠原位肝移植模型,手術成功率92%, 7d存活率達88%。結論在嫻熟細致的外科操作基礎上，精簡術式，改進細節，可成功的建立起大鼠肝移植模型。

原位肝移植； 二袖套法； 動物模型； 大鼠

建立大鼠肝移植模型是缺血-再灌注損傷、排斥反應以及免疫耐受研究的有效手段。自1979 年Kamada等［1］報道二袖套法后, 許多研究者［2-4］進行了各種改良, 并結合自己的體會建立了穩定的大鼠肝移植模型。本實驗采用Kamada “二袖套法”［5］, 結合國內外相關報道進行相應的改進（表1）, 成功地建立了穩定的大鼠肝移植模型, 結合自己的實踐體會,闡述如下：

1　材料與方法

1.1材料

清潔級雄性SD大鼠100只, 體質量180～250 g,購于廣州中醫藥大學實驗動物中心［SCXK（粵）2013-0034］。受體體質量略重于供體。下腔靜脈和門靜脈套管均選用靜脈留置針14 G內徑2.2 mm, 長2.5 mm均留有尾翼, 膽管支架采用靜脈留置針24 G, 長3～4 mm, 兩端削成銳角。自制拉鉤2個，一大塊橡皮泥, 上海手術器械廠顯微外科手術器械包,絲線,灌注液： 0～4 ℃肝素等滲鹽水（100 U/mL）, 保存液： 含肝素25 U/mL的4 ℃乳酸鈉林格氏液, 乙醚麻醉筒。

1.2方法

1.2.1術前準備選擇健康活潑的大鼠, 受體、供體大鼠禁食8～12 h，自由飲水。

1.2.2 供體手術 術前30 min皮下注射的阿托品0.4 mL/kg。體積分數10%水合氯醛0.3 mL/kg, 腹腔注射，腹正中切口進腹, 經陰莖背靜脈注射肝素生理鹽水2 mL（含肝素100 U/mL）, 供肝的游離時很難避免按壓它從而造成肝臟的缺血再灌注損傷［6］, 故用濕棉簽或濕紗布向下牽引肝臟, 解剖第二肝門： 游離肝臟周韌帶, 縫扎左膈肌靜脈。解剖肝下下腔靜脈（subhepatic inferior vena cava, IVC）, 結扎切斷右腎上腺靜脈。游離右腎靜脈水平以上的肝下下腔靜脈, 游離右腎靜脈結扎切斷。解剖第一肝門： 游離膽總管, 自膽總管中、下1/3 處向上V 形剪開前壁,向肝側插入膽管支架管, 5-0絲線固定后, 遠端離斷膽管。分離結扎切斷肝固有動脈, 游離肝門靜脈至脾靜處結扎并剪斷, 留線尾待以后套扎用,適當壓力注入灌注液15 mL 經肝門靜脈（portal vein, PV）灌洗肝臟。灌注速度控制在3～4 mL/min, 均勻低壓, 以肝臟不腫脹為宜［7］, 灌注壓力過高可引起肝細胞損傷,導致肝細胞水腫進而影響供肝質量［8］。于左腎靜脈以下剪斷下腔靜脈, 以便灌洗液順利流出, 使供肝迅速進入冷缺血狀態。灌注同時稍向左側牽拉胃底,暴露肝食管韌帶內的血管交通支,結扎切斷。待肝臟變成土黃色后,剪斷肝下下腔靜脈和門靜脈, 殘端盡量留長。輕輕下牽肝, 用眼科剪剪下肝上下腔靜脈, 不帶膈肌組織。取出肝, 置于0～4℃保存液里。

1.2.3 受體手術 術前30 min按0.4 mL/kg皮下注射阿托品,乙醚吸入麻醉成功后,臥位固定，背部墊高約1 cm,切口同供體，游離肝周韌帶，靠近膈肌結扎切斷左膈肌靜脈。第一肝門分離出膽總管，在左右肝管分叉處結扎切斷膽總管，分離肝固有動脈并結扎切斷, 分離門靜脈至左右支分叉處（圖1）。分離肝下下腔靜脈，連同軟組織結扎腎上腺靜脈不剪短結扎線，留作套管時牽引用。將肝臟翻向左側，離斷肝后韌帶至膈下。血管夾阻斷肝下下腔靜脈。血管夾阻斷門靜脈并用體積分數1%的溫碳酸氫鈉2.0 mL經門靜脈左右分支處注入驅趕肝內血液，即所謂“自體輸血”［9］并在分叉處剪一小口，留做供體袖套置入。以Satinsky鉗貼膈肌夾閉肝上下腔靜脈,緊貼受體肝臟剪斷肝上下腔靜脈及在肝門處剪斷門靜脈左右分支，連同部分肝組織剪斷肝下下腔靜脈，取出肝臟。

1.2.4 原位肝移植 取出供肝置于原位, 適當調整位置，將肝臟向頭側翻起, 將門靜脈左右分支的預置線做牽引。7-0預置縫線連續縫合肝上下腔靜脈。縫完最后一針與第一針尾線打結前，用2 mL等滲鹽水排凈吻合口中空氣，再打結。快速將供體門靜脈袖套插入門靜脈，用5-0絲線固定,開放門靜脈，待部分血液從肝下下腔流出時開放肝上下腔靜脈，結束無肝期。結束無肝期前將各葉輕撥復位，防止出現肝葉充盈不均或淤血，達到真正的“原位肝移植”［10］。此時快速將肝下下腔靜脈袖套插入肝下下腔靜脈，用5-0絲線固定。熟練和完善的手術步驟是縮短無肝期時間的基礎。最后, 將供肝膽總管支撐管插入膽總管中, 結扎固定。擦凈腹腔內少許積血, 左側腰靜脈推注等滲鹽水2.5 mL,喂以質量分數5%葡萄糖水，1 d后進流食。

2　結果

自2013年6月～2014年3月，共施行大鼠原位肝移植50對。統計數據如下： 供體手術約39 ± 2 min, 受體手術時間54±4 min, 受體無肝期16± 2 min, 供肝修整時間13±2 min, 移植物冷缺血時間約55 min。手術成功率（手術成功判定標準： 以大鼠關腹去除固定后能自行翻身、精神好、主動進水、對刺激反應正常、存活24 h以上）為92%（46/50）, 其中1例死于肝上下腔靜脈漏血, 1例死于門靜脈扭曲,1例死于膽漏, 1例死于肝下下腔開放時血栓栓塞。7 d后存活率88% （44/50）, 2例為膽管阻塞。

表 1　本實驗操作在Kamada實驗基礎上主要改進之處

圖1　手術操作示意圖

3　討論

成功建立大鼠原位肝移植模型無論是在臨床實驗, 還是在基礎研究中都具有重要意義, 然而此手術操作程序的復雜, 無肝期操作時間的有限, 在很大程度上限制了大鼠肝臟移植模型快速成功建立和廣泛推廣［11］。作者經過接近1年實踐，在供體靜脈處理，受體門靜脈、肝上下腔靜脈吻合等方面做了改進，可單人直視下操作，操作簡單, 成功率高。

3.1供體靜脈處理

注意事項包括： ①結扎右腎上腺靜脈： 連同血管周圍組織一同結扎，這樣避免了反復翻動尾葉，肝臟質地很脆，避免出血。②左膈靜脈處理： 左膈靜脈與下腔靜脈距離很近，將肝臟向下牽引時，在吸氣時，用顯微鑷子將二者分開，帶線結扎。初學者很容易損傷肝上下腔靜脈，破裂出血，手術失敗。③肝上下腔靜脈的處理： 在處理肝上下腔靜脈時，分離肝后韌帶至膈下, 有時下腔靜脈與食管關系緊密, 下腔靜脈管壁薄, 應在食管上方用頓彎鉗以一定的角度垂直下腔靜脈分離, 否則容易分破下腔靜脈出血, 膈肌破裂造成氣胸。肝上下腔靜脈的修整時要與左膈肌靜脈為標志，還要保證要有足夠的邊緣以便于血管的吻合［12］。④門靜脈： 分離至脾靜脈, 留結扎線, 這樣即可保留足夠門靜脈長度，又可以在作套管時作牽引線和辨別門靜脈前后壁，避免門靜脈扭轉。⑤手術順序合理化： 利用灌注期間的時間處理肝食管之間的交通血管、使游離與灌注兩手術階段重疊進行, 明顯縮短了手術時間。

3.2 受體靜脈處理

注意事項包括： ①門靜脈的處理： 受體肝摘除時,通過在門靜脈左右分支分別用5-0絲線結扎,在分支近肝側剪斷左右支，帶線以做牽引，并在分叉處縱形切開前壁約2 mm，容易將供體門靜脈袖套置入，Hans等［13］處理門靜脈平均時間4 min，本實驗平均時間4±0.3 min，成功率98%。②肝上下腔的處理： 肝上下腔靜脈的吻合占無肝期的大部分,要求吻合速度快，吻合口不漏血，不狹窄。因此，一定要準確區分受體肝上下腔靜脈前后壁層次。左側角吻合時，準確辨認側角（以左膈肌靜脈結扎線為標志）。進針點應偏向后壁, 在肝臟重力牽來作用下，很容易暴露后壁，再開始縫合后壁。進針準確, 切忌反復操作, 易引起出血和撕裂血管。

總之，建立一個穩定的大鼠原位肝植模型并非易事，除了術者應掌握嫻孰的顯微外科技術外，還要有堅強的意志品質，不斷的實踐，總結經驗教訓。本實驗手術方法具有相對簡單無肝期短、手術成功率高、是大鼠原位肝移植的理想術式。

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Probe on Orthotopic Liver Transplantation in Rats by Double- Cuff Technique

ZHANGJie1, DOUMin1, BAOXing1, DAI Jin-yu1, YAN Yu-kuang1, PENGHai-feng2
（1. Department of General Surgery， the Ninth People's Hospital of Shenzhen， Shenzhen 518116， China；2. Longgang District People's Hospital，Shenzhen 518172， China）

ObjectiveTo investigate the surgical techniques for establishing the rat model of orthotopic liver transplantation. MethodsOn the basis of the double-cuff technique of Kamada, Some of the skills of the techniques for the veins of donors and the portal vein and the suprahepaticinferior vena cava of recipients were modified. ResultsOf the 50 rats that underwent orthotopic liver transplantation, 92% survived longer than 24 hours and 88% over 7 days. ConclusionThe operator can successfully establish the rat model of orthotopic liver transplantation by streamline operations and improving the details on the basis of skillful surgical techniques.

Orthotopic liver transplantation； Double-cuff technique； Animal model； Rat

Q95-33

A

1674-5817（2015）05-0406-03

10.3969/j.issn.1674-5817.2015.05.013

2015-02-14

深圳市創新計劃（JCYJ20140411150159437）

張杰（1974-）, 男, 碩士, 副主任醫師, 從事肝膽外科專業。E-mail： 15811831077@163.com