動脈粥樣硬化靶向適配子的親和力篩選

鐘文飛等

[摘要] 目的 篩選動脈粥樣硬化高親和力適配子，為動脈粥樣硬化靶向引導物的體內(nèi)應用提供實驗基礎。 方法 將前期研究獲得的一組巨噬細胞源性泡沫細胞適配子中的12個適配子進行生物素標記，采用酶聯(lián)寡聚核苷酸吸附試驗（ELONA）方法測定其親和力（Kd），采用高脂方法建立載脂蛋白E基因敲除（ApoE-/-）動脈粥樣硬化模型，將親合力最高的適配子Cy5進行熒光標記，激光共聚焦顯微鏡下觀察其與動脈粥樣硬化病變組織的結(jié)合能力。 結(jié)果 12個巨噬細胞源性泡沫細胞的適配子均具有較好的親和力，解離平衡常數(shù)（Kd值）范圍在4.33～39.58 nmol/L之間，其中9號適配子（Apt9）的親和力最高，Kd值為（4.33±0.33）nmol/L，體內(nèi)親和力檢測發(fā)現(xiàn)Apt9能特異性結(jié)合ApoE-/-動脈粥樣硬化血管斑塊病變組織。 結(jié)論 篩選的Apt9適配子能與巨噬細胞源性泡沫細胞和動脈粥樣硬化病變血管組織特異性結(jié)合，可以用于進一步的體內(nèi)研究。

[關(guān)鍵詞] 巨噬細胞源性泡沫細胞；適配子；親和力；動脈粥樣硬化

[中圖分類號] R543.5 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2015）09（b）-0012-05

心腦血管疾病是危害人類健康的主要疾病，動脈粥樣硬化是心腦血管疾病的主要病理基礎，尋求有效的動脈粥樣硬化靶向物，應用于動脈粥樣硬化早期診斷與治療是當前研究動脈粥樣硬化的熱點問題。巨噬細胞源性泡沫細胞形成是動脈粥樣硬化主要的細胞學改變，在動脈粥樣硬化病變斑塊的早期即大量出現(xiàn)，它的形成是動脈粥樣硬化病變形成和發(fā)展的核心步驟，泡沫細胞可以成為動脈粥樣硬化病變診斷和治療的靶點[1]。

指數(shù)富集配體系統(tǒng)進化技術(shù)（systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX）[2]是現(xiàn)有常用的靶向物篩選技術(shù)，通過SELEX技術(shù)可從人工合成的大容量單鏈隨機寡核苷酸文庫中篩選并富集獲得靶物質(zhì)特異性結(jié)合的寡核苷酸適配子，適配子可作為靶向引導物用于疾病的診斷與治療[3]，本研究組前期利用巨噬細胞與泡沫細胞的細胞差異，利用SELEX技術(shù)篩選出了巨噬細胞源性泡沫細胞的12個適配子[4-5]，本研究擬采用酶聯(lián)寡聚核苷酸吸附試驗（enzyme-linked oligonucleotide assay，ELONA）對這些適配子進行Kd檢測，并將篩選出的親和力最高的適配子進一步通過體內(nèi)實驗驗證動脈粥樣硬化病變組織特異性，為動脈粥樣硬化體內(nèi)靶向引導物的研究提供實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株 人單核細胞THP-1細胞株購自中國科學院上海細胞所。

1.1.2 實驗動物 載脂蛋白E基因敲除（apolipoprotein E knockout，ApoE-/-）小鼠20只，雄性，6周齡，體質(zhì)量（17±2）g，購于北京大學實驗動物部，生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2006-0008。

1.1.3 主要試劑 細胞培養(yǎng)基、胎牛血清（Gibco公司）；油紅O、鮭魚精DNA（Sigma公司）；佛波酯（calbiochem公司）；辣根過氧化物酶標記Streptavidin、四甲基聯(lián)苯胺（TMB）顯色液（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；小鼠高脂飼料、普通飼料（廣東省醫(yī)學實驗動物中心）。

1.1.4 主要儀器 多功能酶標儀（美國Biotek公司）；激光共聚焦顯微鏡（日本尼康公司）。

1.2 方法

1.2.1 適配子的合成 生物素與Cy5熒光素標記的適配子由上海生物工程技術(shù)服務有限公司合成。

1.2.2 泡沫細胞模型的建立 THP-1細胞培養(yǎng)于96孔培養(yǎng)板（美國Constar公司）中，置于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。實驗前用100 nmol/L丙二醇甲醚醋酸酯（PMA）誘導72 h，使其分化成巨噬細胞，再用80 mg/L氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL）孵育72 h，誘導分化成泡沫細胞。

1.2.3 動脈粥樣硬化動物模型的建立 ApoE-/-小鼠，普通飼料飼養(yǎng)2周適應環(huán)境后，隨機分成2組，每組10只。正常組給予普通飼料飼養(yǎng)，動脈粥樣硬化模型組在普通飼料的基礎上添加1.5%膽固醇和15%豬油高脂飼養(yǎng)。12周后麻醉處死動物，將主動脈段（自升主動脈至髂總動脈分叉）取出，中性甲醛固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋，用Leitz1560切片機連續(xù)切片，蘇木精-伊紅（HE）染色，經(jīng)病理鑒定，動脈粥樣硬化造模成功。

1.2.4 適配子親和篩選 1×106 THP-1細胞培養(yǎng)于96孔板中，THP-1細胞用100 nmol/L的PMA誘導72 h，使其分化成巨噬細胞，再用80 mg/L ox-LDL共孵育72 h，誘導成泡沫細胞，4%的多聚甲醛固定30 min。用1×磷酸鹽緩沖液（PBS）洗板5次，5%牛血清白蛋白（BSA）于37℃封閉2 h，1×PBST（0.01% Tween-20）洗板5次。用PBS（含0.01%鮭魚精DNA）將生物素標記的適配子與文庫進行稀釋，樣品終濃度分別為1000、400、160、64、25、10、4 nmol/L，每組3個復孔。樣品在95℃處理5 min后立刻置于冰上10 min，加入泡沫細胞的培養(yǎng)孔中37℃孵育1 h，1×PBST洗板5次，拍板。每孔加入50 μL辣根過氧化物酶標記的鏈親和素-PBS溶液（稀釋比1∶3000），37℃孵育30 min后洗滌5次，拍板。每孔加入50 μL TMB顯色液，37℃避光顯色10 min后每孔加50 μL 2 mol/L硫酸終止反應，酶標儀測定450 nm下的吸光度。

1.2.5 9號適配子與動脈粥樣硬化病變小鼠的體內(nèi)熒光成像 模型組與正常組分別經(jīng)尾部靜脈注射0.5 mL（10 μg DNA/10 mg體重）9號適配子（Apt9），30 min后，避光取出主動脈進行常規(guī)冰凍切片，激光共聚焦顯微鏡下觀察并攝像。