2013～2014年上饒市甲1亞型流感病毒HA1基因特性的分析

朱琳+彭軍+王琳

[摘要] 目的 了解上饒市2013～2014年分離到的甲1亞型流感病毒HA1基因變異特性和規(guī)律，分析WHO甲1亞型疫苗推薦株對上饒市甲1亞型流感的預(yù)防效果。 方法 采集流感病例咽拭子標(biāo)本進(jìn)行病毒分離，對分離到的甲1流感病毒采用RT-PCR方法擴(kuò)增病毒基因，進(jìn)行核苷酸序列測定，使用DNAStar、Mage軟件對測序結(jié)果進(jìn)行分析和處理，且與WHO 2013～2014年推薦的疫苗株進(jìn)行比對。 結(jié)果 2013～2014年10株甲1亞型流感病毒HA1沒有發(fā)現(xiàn)核苷酸丟失和插入，上饒市流感病毒分離株與WHO疫苗推薦株之間差異很小，只有A/JiangxiXinzhou/SWL116/2014株有2個變異位點(diǎn)位于抗原決定簇A區(qū)和抗原決定簇B區(qū)內(nèi)。 結(jié)論 2013～2014年WHO疫苗推薦株生產(chǎn)的疫苗對我市這兩年甲1亞型流感具有一定的預(yù)防效果，可推廣使用。

[關(guān)鍵詞] 甲1亞型流感病毒；分離株；疫苗株；HA區(qū)

[中圖分類號] R373.3 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1674-4721（2015）09（c）-0004-03

Analysis of the characteristics of HA1 gene in influenza virus subtype A1 in Shangrao city from 2013 to 2014

ZHU Lin PENG Jun WANG Lin ZHANG Yan-yan

Shangrao Center for Disease Control and Prevention，Jiangxi Province，Shangrao 334000，China

[Abstract] Objective To understand the characteristics and regularity of HA1 gene mutation in influenza virus subtype A1 isolated from 2013 to 2014 in Shangrao City，and to analyze the preventive effect of WHO subtype A1 vaccine against Shangrao. Methods Influenza case throat swab specimens were selected as the research object，and virus isolation was carried out，and the RT-PCR method was used to isolate the virus gene.The method was used to determine the nucleotide sequence.The results were analyzed and processed using Mage and DNAStar software.The vaccine strains recommended by WHO 2013 to 2014 were compared. Results 10 influenza HA1 virus was not found to be lost and inserted，and the difference between vaccine and WHO vaccine was very small，and only 2 of A/JiangxiXinzhou/SWL116/2014 strains were located in A region and B region. Conclusion 2013-2014 WHO vaccine recommended for the production of vaccine against the city of those years subtype A1 of influenza has a certain preventive effect，and can be used to promote.

[Key words] Influenza virus subtype A1；Isolate；Vaccine strain；HA region

流感病毒為正黏病毒科單鏈負(fù)股分節(jié)段RNA病毒，分為甲、乙、丙三型，其中甲型流感病毒表面血凝素是該病毒主要的抗原，能使人體產(chǎn)生保護(hù)性抗體， 但抗原變異頻繁，能反復(fù)有效地突破人體的免疫屏障，引起流感流行[1-2]。2009年在墨西哥暴發(fā)的甲型H1N1流感，最初被稱為“人感染豬流感”，后將其更名為“甲型H1N1流感”，其就是因?yàn)榛蜃兓瘜?dǎo)致的抗原漂移，使疫苗不能有效防控，從而引起流感疫情的暴發(fā)。本研究分析上饒市甲型H1N1流感病毒HA1的基因序列變化情況，并與WHO疫苗推薦株進(jìn)行比較，分析流感疫苗特異性的保護(hù)作用，為流感的預(yù)防和控制提供科學(xué)支持。

1 材料與方法

1.1 樣本來源

2013～2014年流感監(jiān)測哨點(diǎn)醫(yī)院和疑似流感疫情采集的流感樣病例咽拭子樣本[3]。

1.2 病毒分離與鑒定

用狗腎傳代細(xì)胞（MDCK）進(jìn)行流感病毒分離，根據(jù)細(xì)胞病變和微量血凝試驗(yàn)（HA）來判斷是否存在流感病毒，將HA滴度≥1∶8的樣本采用血凝抑制試驗(yàn)（HI）進(jìn)行流感病毒型別鑒定[4]。所有流感毒株全部經(jīng)過國家流感中心復(fù)核確認(rèn)。MDCK和標(biāo)準(zhǔn)血清均由國家流感中心提供。

1.3 病毒選擇

隨機(jī)抽取10株從不同年份病例咽拭子樣本中分離到的新型甲型H1N1流感病毒，進(jìn)行基因擴(kuò)增和測序。

1.4 病毒RNA提取和RT-PCR擴(kuò)增

取病毒細(xì)胞培養(yǎng)液200 μl，用德國QIAGEN的RNeasy Mini Kit試劑進(jìn)行病毒RNA的提取，再使用QIAGEN的One Step RT-PCR Kit試劑進(jìn)行RT-PCR試驗(yàn)。試驗(yàn)條件為60℃ 1 min，42℃ 10 min，50℃ 30 min，95℃ 15 min[2]。PCR循環(huán)為94℃ 40 s，50℃ 40 s，72℃ 1 min 30 s，35次循環(huán)，72℃ 10 min。

1.5 引物和核苷酸序列測定

引物1：5′-AGCAAAAGCAGGGGAAAATAAAA-CC-3′；引物2：5′-CAATGAAACCGGCAATGGCTCC-3′[5]。引物由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，PCR產(chǎn)物序列測定送上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。

1.6 基因序列分析

氨基酸和核苷酸分析采用DNAStar 5.0、Mage 4.0序列分析軟件，將WHO北半球新型甲型H1N1流感疫苗推薦株A/California/07/2009（H1N1）的HA1基因序列作為參比分析。

2 結(jié)果

2.1 2013～2014年上饒市流感病毒的分離情況

2013～2014年共分離鑒定流感病例樣本2273件，分離到甲1亞型流感病毒47株。其中2013年分離鑒定流感病例樣本1204件，分離到甲1亞型流感病毒26株；2014年分離鑒定流感病例樣本1069件，分離到甲1亞型流感病毒21株。

2.2 氨基酸和核苷酸序列的分析結(jié)果

隨機(jī)抽取10株甲1亞型流感病毒進(jìn)行HA1區(qū)核苷酸序列檢測，選2013年分離的毒株4株，2014年分離的毒株6株。對HA1基因PCR產(chǎn)物經(jīng)核苷酸序列測定、序列拼接后，經(jīng)DNAStar 5.0、Mega 4.0軟件分析，每株病毒HA1基因片段均為1701 bp。2013年和2014年的疫苗株均為A/California/07/2009（H1N1），我市2013年和2014年分離株與疫苗株的同源性比對分別為97.7%～98.2%和97.7%～98.0%，2013和2014年變異數(shù)分別為7～9個和8～11個，在HA1基因序列的種系進(jìn)化樹上（圖1），可見選擇的這10株甲1亞型毒株與A/California/07/2009（H1N1）在同一分支上，除 A/JiangxiXinzhou/SWL116/2014株有2個變異位點(diǎn)位于抗原決定簇A區(qū)內(nèi)和抗原決定簇B區(qū)內(nèi)（表1），其他所有毒株均未在抗原決定簇區(qū)域發(fā)生變異，提示甲型H1N1疫苗具有很好的保護(hù)作用。

圖1 上饒市2013～2014年甲1毒株HA1基因序列的種系進(jìn)化樹圖

3 討論

HA和NA是流感病毒重要的表面抗原，它與流行性感冒的傳染性和流行性非常密切。甲1亞型流感病毒HA1區(qū)域上最少有A、B、C、D和E 5個抗原決定簇，其中A和B抗原決定簇對流感病毒抗原性的影響最大，抗原決定簇區(qū)域上氨基酸發(fā)生替換，會引起HA和NA發(fā)生抗原漂移，從而引起流感病毒抗原性的改變[6-7]。由于HA和NA發(fā)生抗原漂移，人體在流感病毒感染后所產(chǎn)生的特異性抗體，不能有效阻止新變種流感病毒的侵犯，從而引起流感暴發(fā)流行[8]。所以WHO依據(jù)全球流感監(jiān)測網(wǎng)絡(luò)，對各地流感流行毒株進(jìn)行分析，每年對流感疫苗的構(gòu)成作出相應(yīng)改變，推薦新一輪的流感疫苗株供全球使用[9]。

在本研究基因的種系進(jìn)化樹中，2013～2014年毒株與疫苗推薦株在一個分支上，這表明這兩年毒株與疫苗推薦株親緣性較近[10]。變異分析更能說明這點(diǎn)，通過對上饒市2013～2014年新型甲型H1N1流感毒株與疫苗推薦株A/California/07/2009（H1N1）比較，發(fā)現(xiàn)有氨基酸位點(diǎn)發(fā)生變異，其中2013年毒株變異位點(diǎn)有變異數(shù)為7～9個；2014年毒株變異位點(diǎn)有變異數(shù)為8～11個[11]，說明上饒市新型甲型流感毒株變異的氨基酸位點(diǎn)逐年在增多，仍需要密切關(guān)注。

研究表明，一個具有流行病學(xué)意義的流感新變種需在HA1區(qū)蛋白分子上至少有4個以上的氨基酸發(fā)生替換，并且這4個替換需分布在2個以上抗原決定簇區(qū)[12]。本研究中2014年有一株毒株A/JiangxiXinzhou/SWL116/2014有2個變異位點(diǎn)，分別在決定簇A區(qū)141位和決定簇B區(qū)192位發(fā)生一個氨基酸替換，其他所有毒株均未在抗原決定簇區(qū)域發(fā)生變異[11-12]。這說明上饒市新甲型H1N1的HA1區(qū)的變異尚未達(dá)到需要更換疫苗的程度，目前的疫苗仍對人群有保護(hù)作用，但是抗原位點(diǎn)的變異逐年增多，上饒市仍然存在新型甲型H1N1流感再次流行的風(fēng)險[13]。

本研究對在2013～2014年上饒市分離到的甲1亞型流感病毒HA1區(qū)進(jìn)行核苷酸序列檢測，并結(jié)合流感抗原性進(jìn)行資料分析，以探索地方流感毒株的基因變異和型別變遷規(guī)律，及時捕獲有意義的流感變異毒株，指導(dǎo)今后的流感診斷、監(jiān)測和防控工作，為新型甲型H1N1流感病毒的預(yù)防和控制提供科學(xué)支持。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 中國疾病預(yù)防控制中心.全國流感監(jiān)測實(shí)施方案（2010年版）[Z].2010.

[2] 熊英，鄒明霞，龔甜，等.2004-2006年江西省乙型流感病毒HA1基因特性分析[J].中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2008， 18（2）：211-213.

[3] 徐翠玲，向妮娟，張燁，等.2004-2005年中國A（H1N1）亞型流感病毒抗原性及基因特性研究[J].中華實(shí)驗(yàn)和臨床病毒學(xué)雜志，2006，20（2）：27-29.

[4] 郭元吉，程小雯.流行性感冒及其實(shí)驗(yàn)技術(shù)[M].北京：中國三峽出版社，1997：16-43.

[5] 李敏紅，徐昌平，盧亦愚，等.2005年-2009年浙江省甲1亞型流感病毒株NA區(qū)基因特性分析[J].中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2011，21（7）：1712-1714.

[6] 熊英，鄒明霞，馬雪蘭，等.江西省2005～2006年甲1亞型流感病毒株與疫苗株的HA1區(qū)差異分析[J].現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué)，2008，35（2）：322-326.

[7] 吳少慧，何雅慧，于偉，等.遼寧省甲1亞型流感病毒HA1基因變異分析[J].中國公共衛(wèi)生，2007，23（12）：1522-1523.

[8] 孔梅，段衛(wèi)平，李曉燕，等.天津地區(qū)2005年甲1亞型流感病毒HA1區(qū)基因特性分析[J].公共衛(wèi)生與預(yù)防醫(yī)學(xué)，2006，17（5）：32-34.

[9] 吳彥媛.甲流H1N1流感病毒性肺炎的臨床觀察及護(hù)理分析[J].吉林醫(yī)學(xué)，2015，36（6）：1205-1207.

[10] 楊建課，袁健，高繼光，等.人易感H6N1禽流感病毒血凝素蛋白的B細(xì)胞抗原表位預(yù)測及進(jìn)化分析[J].細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志，2015，31（1）：14-17，22.

[11] 王玉濤，李菁，夏曉玲，等.臭靈丹乙醇提取物體外抑制甲1型流感病毒實(shí)驗(yàn)研究[J].昆明醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2015， 36（2）：4-6，28.

[12] 屈素潔，莫勝蘭，鄒聯(lián)斌，等.禽流感病毒H5、H7和H9亞型一步法多重RT-PCR檢測方法的建立[J].動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2015，36（3）：5-8.

[13] 劉雪婷，王珊，張俊艷，等.H7N9流感病毒HA、NA蛋白的抗原表位預(yù)測及其與HLA-Ⅱ類等位基因的相關(guān)性分析[J].中國免疫學(xué)雜志，2015，31（1）：16-21.

（收稿日期：2015-06-30 本文編輯：衛(wèi) 軻）