交聯透明質酸鈉細胞支架材料中交聯劑殘留量的測定*

張治云，劉榮磊，陳建英，邢玉仁，王勤，凌沛學△

(1.山東省藥學科學院，山東省生物藥物重點實驗室 山東 濟南 250101；2.山東福瑞達醫藥集團公司，山東省黏膜與皮膚給藥技術重點實驗室，山東 濟南 250101)

1 引 言

透明質酸(Hyaluronic acid，HA)是由D-葡糖醛酸和N-乙酰基-D-氨基葡糖雙糖單位重復連接組成的一種鏈狀聚陰離子黏多糖[1]，是構成皮膚、玻璃體、關節滑液和軟骨組織的重要成分，具有獨特的理化性質和生物學功能[2]。HA是軟骨基質組成成分之一，作為軟骨細胞生長的基質，能促進軟骨細胞代謝，并維持軟骨細胞表型、促進軟骨基質分泌[3]，是構建復合軟骨細胞支架的理想材料之一。天然的HA制備的支架材料具有良好的水溶性，但存在容易分散和被肌體組織中存在的酶及自由基降解，局部存留的時間較短的缺點，且缺乏維持支架材料所必須的力學性能[4]；而通過引入交聯劑使鏈狀的HA交聯形成網狀結構所得到的材料，可以在一定程度上克服上述天然HA材料的缺陷，通過調節交聯程度及制備工藝參數，可獲得具有適宜降解速度和適宜孔隙大小的材料，有望成為一種較理想的組織工程細胞支架材料[5]。HA常用的交聯劑有二乙烯基砜(divinyl sulfone， DVS)和 1,4-丁二醇二縮水甘油醚(1,4-butanediol diglycidyl ether，BDDE)，比較而言，BDDE較DVS具有毒性小、反應性好等優點，正逐步取代 DVS 作為交聯透明質酸(cross-linked hyaluronic acid，CHA)的主要交聯劑[6]。由于BDDE化學性質活潑，其單體有致突變和致癌的潛在風險，因此，需要嚴格控制CHA支架材料中BDDE殘留量。本研究建立了氣相色譜法測定CHA細胞支架材料中BDDE殘留量的方法，通過方法學研究證明方法專屬性強、重現性好、靈敏度高，可用于CHA中BDDE殘留量測定。

2 實驗材料與方法

2.1 實驗材料

氣相色譜儀(Agilent 7890A ，美國 Agilent)；自動進樣器(Agilent G4513A)；氫火焰離子化檢測器(FID) ；電子分析天平(Mettler XS205，瑞士 Mettler)。

無水乙醇(天津市科密歐化學試劑有限公司，批號：20130514，色譜純)；BDDE(美國Sigma—Aldrich)；CHA細胞支架材料(自制，批號：20130501、20130502、20130503)。

2.2 實驗方法

2.2.1色譜條件 安捷倫HP-5(30 m×0.32 mm，0.25 μm)毛細管柱；進樣口溫度為200℃，不分流模式進樣；FID溫度為250℃；載氣為氮氣，流速為2.0 ml·min-1；柱溫采用程序升溫，初始溫度為90℃，以15℃·min-1升溫至250℃，保持8 min；進樣體積為1.0 μl。

2.2.2試樣的制備 精密稱取BDDE 16.65 mg，置事先加入適量無水乙醇的50 ml量瓶中，加無水乙醇稀釋至刻度，搖勻，精密量取1.0 ml置50 ml量瓶中，加無水乙醇稀釋至刻度，搖勻，作為貯備液，精密量取3.0 ml置25 ml量瓶中，加無水乙醇-水(6：4)稀釋至刻度，搖勻，作為對照品溶液。取CHA細胞支架材料80 mg，精密稱定，剪碎，置10 ml量瓶中，加水4.0 ml靜置過夜，加無水乙醇稀釋至刻度，強力振搖10 min，用0.22 μm有機微孔濾膜過濾，取續濾液作為供試品溶液。

2.2.3專屬性試驗 精密量取空白溶劑(無水乙醇-水=6：4)1.0 μl 注入氣相色譜儀，記錄色譜圖；另精密量取BDDE 對照品溶液1 μl注入氣相色譜儀，記錄色譜圖。

2.2.4線性關系試驗 精密量取2.2.2項下BDDE對照品貯備液0.5、1、3、5、7 ml，分別置25 ml量瓶中，加溶劑(無水乙醇-水=6：4)稀釋至刻度，搖勻，分別量取1 μl注入氣相色譜儀，記錄色譜圖，以BDDE峰面積為縱坐標，濃度為橫坐標，繪制標準曲線。

2.2.5系統精密度試驗 取2.2.2項下BDDE對照品溶液，按2.2.1條件連續測定6次，計算BDDE峰面積的精密度。

2.2.6對照品溶液穩定性試 BDDE對照品溶液配制后每隔一定時間，精密量取1 μl注入氣相色譜儀，記錄色譜圖，考察BDDE峰面積隨時間的變化趨勢。

2.2.7定量限與檢測限 取2.2.2項下BDDE對照品貯備溶液，逐級稀釋成不同濃度的對照品溶液，依法測定，記錄BDDE峰的信噪比。以S/N=10時為定量限，S/N=3時為檢出限。

2.2.8重復性試驗 取CHA細胞支架材料(批號：20130501)6份，每份80 mg，精密稱定，依法測定樣品中BDDE殘留。

2.2.9回收率試驗 取CHA細胞支架材料(批號：20130501)9份，每份80 mg，剪碎，置10 ml量瓶中，加水4.0 ml使充分溶脹；精密稱取BDDE 13.32 mg，置事先加入適量無水乙醇的100 ml量瓶中，加無水乙醇稀釋至刻度，搖勻，精密量取1.0 ml置50 ml量瓶中，加無水乙醇稀釋至刻度，搖勻，作為貯備液。各取3份溶脹后的細胞支架材料，分別加上述對照品貯備液2.4、3.0和3.6 ml，加無水乙醇稀釋至刻度，強力振搖10 min，用0.22 μm有機微孔濾膜過濾，取續濾液依法測定，計算BDDE回收率。

2.2.10樣品測定 精密稱取CHA細胞支架材料(批號：20130501、20130502、20130503)，各約80 mg，置10 ml量瓶中，依法測定樣品中BDDE殘留。

3 實驗結果

3.1 專屬性試驗

空白溶劑進樣，在BDDE出峰處無干擾峰，見圖1。

圖1 空白溶劑(A)及BDDE對照品溶液色譜圖(B)

3.2 線性關系試驗

在0.133～1.865 μg·ml-1范圍內BDDE的濃度與峰面積的線性關系良好，相關系數為0.9993。

3.3 系統精密度試驗

對照品溶液連續測定6次，BDDE峰面積RSD為1.86 % (n=6)，方法精密度良好。

3.4 對照品溶液穩定性試驗

72 h內BDDE峰面積無明顯變化趨勢，RSD為2.42 % (n=8)，表明BDDE對照品溶液配制后至少在72 h內穩定。

3.5 定量限與檢測限

BDDE定量限為0.104 μg·ml-1，檢出限為0.036 μg·ml-1。

3.6 重復性試驗

同一批次樣品測定6次，均未檢測到BDDE殘留。

3.7 回收率試驗

BDDE回收率見表1。

表1 BDDE回收率試驗結果

3.8 樣品測定

CHA細胞支架材料(批號：20130501、20130502、20130503)，均未檢出BDDE。

4 討論

細胞支架材料是組織工程領域的重要組成部分，理想的細胞支架材料應具有良好的生物相容性，適當的生物可降解性，易加工成形，并可在一定時間內保持外觀和結構的完整性，具有一定機械強度能維持細胞形態和表型，并促進細胞粘附與增殖，誘導組織再生[7]。HA作為軟骨細胞生長的基質，能促進軟骨細胞代謝，是構建復合軟骨細胞支架的理想材料之一，通過引入交聯劑，使鏈狀的HA交聯形成網狀結構，可延長材料在組織局部的存留的時間。

HA常用的交聯劑有DVS和BDDE，由于交聯劑化學性質活潑，單體有致突變和致癌的潛在風險，因此，需嚴格控制CHA中游離交聯劑的殘留量。朱彬等[8]、王悅等[9]采用氣相色譜法測定DVS交聯透明質酸鈉凝膠中交聯劑殘留，樣品處理采用乙醇萃取，使HA形成白色沉淀而DVS溶于乙醇中，直接進樣測定。馮海等[6]采用熒光分光光度法和氣相色譜法分別測定CHA凝膠中BDDE殘留，兩種方法定量限分別為0.53 μg·ml-1和1.85 μg·ml-1ml-1。自制CHA細胞支架材料為厚度1.5～2.0 mm的多孔狀膜片，直接加乙醇，支架材料部分漂浮于乙醇中，不溶脹，不利于游離BDDE的提取。將支架材料剪碎后加適量水使其充分溶脹成凝膠，再加乙醇使CHA形成均勻絮狀沉淀，可充分提取游離的BDDE，本試驗通過色譜條件優化，采用不分流模式溶液直接進樣，BDDE定量限為0.104 μg·ml-1ml-1，方法的檢測靈敏度高于已報道的熒光分光光度法及氣相色譜法。FDA批準的Restylane Silk Injectable Gel為采用BDDE交聯的透明質酸鈉凝膠，用于皮膚植入矯正口周皺紋，其濃度為20 mg·ml-1ml-1，產品中BDDE殘留限值為2 μg·ml-1mg-1，折合成CHA中BDDE殘留限值為0.1 μg·ml-1mg-1，參照該產品將CHA支架材料中BDDE殘留限值暫定為0.1 μg·mg-1。