TGF-β對鼠牙源性間充質細胞生物學行為的影響

楊 薇

(中國中醫科學院廣安門醫院南區口腔科，北京 102618)

1 引 言

生長因子作為誘導信號在上皮-間充質相互作用中有著重要作用，轉化生長因子β(transforming growth factor beta，TGF-β)是TGF-β細胞因子超家族的成員之一，參與調控牙胚發育、成牙本質細胞分化和胞外基質形成，在牙齒發育和牙髓損傷修復過程中發揮重要功能[1～2]。最新報道TGF-β與酸性成纖維細胞生長因子共同作用可促進牙乳頭細胞極化和成牙本質細胞樣細胞的功能分化以及前期牙本質的分泌[3]。本實驗對出生后4 d大鼠牙源性間充質細胞離體培養并從時間效應上探討TGF-β對其增殖和分化的影響，旨在探討TGF-β對牙齒發育的調控作用模式。

2 材料與方法

2.1 動物、試劑、儀器

4～5 d SD大乳鼠,DMEM培養基,胎牛血清,胰蛋白酶,MTT,TGF-β,ALP檢測試劑盒,Triton-100,CO2孵箱,體視顯微鏡,倒置顯微鏡,酶聯免疫檢測儀。

2.2 細胞培養

出生后4 d SD大鼠,分離上、下頜骨，取第一、二磨牙牙胚,DMEM液漂洗三遍,剪成糜狀,置于含10%胎牛血清的DMEM的培養瓶中。置37℃、5%CO2孵箱中，2～3 d換液，細胞伸展覆蓋培養瓶底80%～90%時,細胞貼壁法進行消化并傳代。

2.3 細胞計數法檢測細胞粘附情況

取生長良好的第四代牙源性間充質細胞，配成1.0×105/ml濃度接種于24孔板中，每孔1 ml，2～3 d換液1次，每隔24 h取3孔細胞，PBS沖洗，消化計數，每孔計三次，取平均值。以時間(d)為橫坐標，細胞數(n×104)為縱坐標，繪制生長曲線圖。

2.4 TGF-β對細胞增殖及 ALP 活性的影響

2.4.1接種細胞 將第四代牙源性間充質細胞，消化，離心，調整密度為1.0×104/ml，接種于96孔板，待細胞貼壁后，棄去原培養液，加入5 ng/ml的TGF-β培養液200 μl，設立無細胞的空白組和TGF-β濃度為零的對照組，2～3 d換液。

2.4.2MTT測定 1、3、5、7 d，每組取四孔，每孔加入5 mg/ml的MTT液20 μl，37℃孵育4 h，終止培養，吸棄孔內培養液，加入150 μl DMSO，微量振蕩器震蕩10 min，酶聯免疫檢測儀，波長490 nm，檢測每孔光密度值(OD)。

2.4.3ALP活性測定 1、3、5、7 d，每組取四孔，吸棄培養液，PBS沖洗，加50 μl 0.1% Triton X-100，4℃過夜，加入100 μl ALP抗體，孵育30 min，加入0.2 mol/L氫氧化鈉50 μl，酶聯免疫檢測儀410 nm波長測定OD值。

3 實驗結果

3.1 細胞的培養觀察

培養3～4 d后細胞從組織塊邊緣爬出，形成“生長暈”，最早出現多星形或梭形成纖維樣細胞，散在，體積大，略扁平，傳代后細胞生長旺盛，呈長梭形，胞體豐滿，胞質均勻，少數細胞胞體可出現一個或多個突起。

圖1 傳代牙源性間充質細胞×100

圖2 TGF-β誘導后的牙源性間充質細胞×400

3.2 誘導后細胞形態學變化

經TGF-β誘導5 d后，倒置顯微鏡下可見細胞生長狀態良好，排列整齊，大量細胞具有細長的單極細胞漿突起，胞核位于突起的一側，一些單極細胞出現平行排列狀；對照組生長狀態良好，但突起細胞較少(見圖2)。

3.3 細胞生長曲線

在接種后1 d，細胞數有所下降，但到第2 d細胞總數開始增加，到第3～5 d進入指數增長期，第6 d以后，細胞增殖速度減慢，進入平臺期，整個曲線呈“S”形，符合一般細胞生長規律。

3.4 TGF-β對牙源性間充質細胞的增殖的影響

隨著培養時間的延長，OD值逐漸增高，培養第1、3、5、7 d均有統計學差異(P<0.05)，說明TGF-β對牙源性間充質細胞增殖起作用且隨時間的延長而加強(見表1)。

表1 TGF-β對于牙源性間充質細胞增殖的影響

3.5 TGF-β對細胞ALP活性的影響

隨著培養時間的延長，OD值逐漸增高，培養第1、3、5、7 d均與對照組比有統計學差異(P<0.05)，說明TGF-β能夠增強牙源性間充質細胞的ALP活性且隨培養時間的延長而加強(見表2)。

表2 TGF-β對于牙源性間充質細胞ALP活性的影響

4 討論

牙齒是一種多胚層起源的器官，牙源性間充質細胞是牙本質和牙髓組織共同的起源細胞，其增殖和分化能力很強，其中牙釉質來源于牙胚發育早期的牙源性上皮細胞,而牙髓牙本質復合體起源于其周圍的牙源性間充質細胞,兩種細胞通過信號分子產生復雜的交互作用發育成牙齒,這種交互作用調控牙胚發育朝著精確而有序的方向進行[4-5]。TGF-β是 TGF-β細胞因子超家族的成員之一，通過調節細胞外基質、核內轉錄因子、細胞粘附分子等的表達，在牙胚發育、成牙本質細胞分化和第三期牙本質形成中發揮重要作用[6]。最新報道 TGF-β與酸性成纖維細胞生長因子共同作用可促進牙乳頭細胞極化和成牙本質細胞樣細胞的功能分化以及前期牙本質的分泌[3]。

本實驗體外培養牙源性間充質細胞，因缺乏牙源性上皮中各種信號分子的誘導作用，所以在培養液中加入5 ng/mLTGF-β。鏡下觀察可見大量細胞發生形態學改變，出現單側較長的細胞突起。MTT法發現1、3、5、7 d，TGF-β對于細胞增殖活力均與對照組相比有顯著性差異，提示TGF-β能刺激體外培養的牙源性間充質細胞增殖。

ALP是重要的礦化組織相關蛋白，在硬組織形成中促進鈣化的作用較為肯定，是牙乳頭細胞分化和牙本質形成的重要標志之一。ALP活性增高被認為是成牙本質前體細胞分化、發生生物礦化的前提條件，與細胞分化狀態密切相關。分化程度越高，分泌礦化基質的能力越強，則ALP活性越高。研究顯示，成牙本質細胞和前體成牙本質細胞的ALP活性水平均比未分化的間充質細胞高[7-5]。在本實驗中，1、3、5、7 d，TGF-β對ALP的影響持續增加，與對照組相比有統計學意義，說明隨著作用時間的延長，發生分化的細胞數量增多、分化程度增高，提示TGF-β在鼠牙源性間充質細胞分化和礦化過程中可能起著重要的作用。綜上所述， TGF-β可以誘導培養早期的牙源性間充質細胞的增殖與分化，并隨時間延長，效應逐漸增強。