峨眉大黃姜的莖尖脫毒與植株再生

張玨等

摘要：為提高姜莖尖成苗率及試管苗的增殖效率，以峨眉大黃姜為供試材料，以MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，研究了不同激素配比對(duì)峨眉大黃姜莖尖成芽率、試管苗增殖率、生根效果的影響。試驗(yàn)結(jié)果表明，激素配比為MS+6-BA 0.1 mg/L+NAA 0.05 mg/L+GA3 0.3 mg/L 時(shí)，誘導(dǎo)莖尖成芽效果最好，成芽率為83.3%。脫毒苗叢生芽誘導(dǎo)最佳激素配比為：MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L，誘導(dǎo)率為92.5%，平均芽數(shù)為12.4個(gè)；生根效果激素配比以MS+IBA 0.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L為最佳，誘導(dǎo)率為100%，平均生根數(shù)為17.6條。

關(guān)鍵詞：峨眉大黃姜；莖尖脫毒；激素配比；植株再生

中圖分類(lèi)號(hào)： S632.504文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2015）09-0077-03

收稿日期：2014-11-19

基金項(xiàng)目：四川省教育廳科研項(xiàng)目（編號(hào)：13ZB0342）；成都學(xué)院人才工程科研啟動(dòng)項(xiàng)目（編號(hào)：20819031）。

作者簡(jiǎn)介：張玨（1976—），女，四川成都人，博士，講師，主要從事藥用植物資源開(kāi)發(fā)及利用研究。Tel：（028）84616308；E-mail： zhangjue@cdu.edu.cn。

通信作者：王躍華，教授，主要從事藥用植物資源開(kāi)發(fā)及利用研究。E-mail：wangyaohua888@yahoo.com.cn。姜（Zingiber officinale Rosc）[1]為姜科姜屬多年生宿根草本植物。姜科植物姜的根莖，形如掌狀，它含有揮發(fā)油、姜辣素、黃酮類(lèi)、酚類(lèi)等物質(zhì)及多種氨基酸[2]，是一種用途廣泛的藥食兼用植物。近年來(lái)，隨著食療保健在全世界范圍的興起，各國(guó)食品、醫(yī)藥、生物學(xué)家對(duì)姜的研究日益廣泛，姜在食品工業(yè)中的開(kāi)發(fā)前景廣闊。人們已經(jīng)對(duì)姜的成分、藥理、栽培技術(shù)和快速繁殖等方面有了較多的研究。姜以根狀莖作為繁殖材料，繁殖系數(shù)低，容易通過(guò)種姜傳播病害而且長(zhǎng)期無(wú)性繁殖造成種性退化。1977年Hosoki等首先進(jìn)行姜組織培養(yǎng)的研究[3]，迄今為止，在脫毒快繁、花器官培養(yǎng)、體細(xì)胞胚胎發(fā)生、器官發(fā)生、原生質(zhì)體培養(yǎng)和種質(zhì)保存等方面取得了一定進(jìn)展[4]。目前對(duì)姜的莖尖脫毒及植株再生研究較多，但對(duì)于較有四川特色的峨眉大黃姜的莖尖脫毒及離體快繁還未見(jiàn)報(bào)道。本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)峨眉大黃姜的莖尖剝離和離體培養(yǎng)來(lái)快速繁殖姜脫毒種苗，研究不同濃度激素配比對(duì)莖尖的成苗率、叢生芽誘導(dǎo)率、生根的影響，以期篩選出大黃姜繁殖速度快、縮短培養(yǎng)周期、建立快繁技術(shù)體系的最佳激素配比，為解決峨眉大黃姜品種退化問(wèn)題和實(shí)現(xiàn)脫毒種苗的規(guī)模化、工廠化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

峨眉大黃姜的根狀莖由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院藥用植物園惠贈(zèng)。

1.2方法

1.2.1外植體的獲取及消毒精選塊大、皮色黃亮、無(wú)病蟲(chóng)危害的健壯根狀莖作為外植體，洗凈表面泥土后，用50%多菌靈可濕性粉劑800倍液對(duì)其進(jìn)行消毒15 min，置于（37±2）℃條件下恒溫培養(yǎng)箱熱處理28 d鈍化病毒，待姜芽長(zhǎng)至10～2.5 cm時(shí)，將姜芽掰下，用自來(lái)水沖洗1～2 h，移入接種室。在超凈工作臺(tái)上剝?nèi)ソ勘韺尤~片，用75%乙醇消毒 20 s，用無(wú)菌水沖洗3次，再用0.1%氯化汞消毒10 min后，用無(wú)菌水洗5次，用無(wú)菌濾紙吸干表面水分，體視顯微鏡下用解剖針剝離莖尖（約0.3～0.5 mm）并將其接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。

1.2.2莖尖離體培養(yǎng)以MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加不同濃度激素，研究不同濃度配比對(duì)莖尖分化成苗的影響。主要采用不同濃度GA3和6-BA進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)，GA3濃度為0.1、0.3 mg/L，6-BA濃度為0.1、0.2 mg/L，并結(jié)合 005 mg/L NAA作為莖尖培養(yǎng)的培養(yǎng)基，每處理10個(gè)莖尖，重復(fù)3次。各處理培養(yǎng)基配方分別為： （1）：MS+0.05 mg/L NAA+0.1 mg/L 6-BA+0.1 mg/L GA3；（2）：MS+0.05 mg/L NAA+0.1 mg/L 6-BA+0.3 mg/L GA3；（3）：MS+ 0.05 mg/L NAA+0.2 mg/L 6-BA+0.1 mg/L GA3；（4）：MS+0.05 mg/L NAA+0.2 mg/L 6-BA+0.3 mg/L GA3。將姜莖尖接種至上述培養(yǎng)基中，黑暗培養(yǎng)，每3 d觀察1次，待莖尖伸長(zhǎng)膨大后，置于光照度為1 800～2 000 lx、光照時(shí)數(shù)14 h/d、溫度26 ℃條件下進(jìn)行培養(yǎng)，每3 d觀察1次，60 d 后統(tǒng)計(jì)成活率，80 d后統(tǒng)計(jì)成苗率，比較各處理的成活率、成芽率的差異。待莖尖成苗后，繁殖到一定量剪其葉片進(jìn)行病毒檢測(cè)（酶聯(lián)免疫吸附法），經(jīng)檢測(cè)合格后進(jìn)行繼代培養(yǎng)。

1.2.3脫毒苗叢生芽誘導(dǎo)增殖培養(yǎng)將病毒檢測(cè)合格的脫毒苗轉(zhuǎn)接于含不同濃度激素配比的MS快繁誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，篩選最佳增殖培養(yǎng)基配方。各處理的培養(yǎng)基配方分別為：（5）：MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.05 mg/L； （6）：MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L；（7）：MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L；（8）：MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.05 mg/L；（9）：MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L；（10）：MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L。每處理接種5瓶，每瓶6苗，重復(fù)3次。每5 d觀察1次，比較不同激素配比對(duì)姜脫毒苗叢生芽誘導(dǎo)增殖效率的影響，并篩選最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基。

1.2.4根的誘導(dǎo)將苗高3 cm左右的叢生芽分成單株，轉(zhuǎn)入不同濃度激素配比的1/2MS生根培養(yǎng)基。生根培養(yǎng)基配方分別為：（11）： 1/2MS+0.5 mg/L NAA；（12）： 1/2MS+1.0 mg/L NAA；（13）： 1/2MS+0.1 mg/L IBA；（14）： 1/2MS+0.5 mg/L IBA；（15）： 1/2MS+0.1 mg/L IBA+0.5 mg/L NAA。培養(yǎng)基中加入3.0%蔗糖、0.45%瓊脂、0.2%活性炭，pH值5.6～5.8。每處理接種10瓶，每瓶3苗，重復(fù)3次。每7 d觀察1次，比較不同激素配比對(duì)姜組培苗生根的影響，并篩選最適生根培養(yǎng)基。最后將生根誘導(dǎo)成功的組培苗移栽到基質(zhì)中，在大棚中進(jìn)行煉苗，培養(yǎng)10 d后，統(tǒng)計(jì)成活率。

2結(jié)果與分析

2.1不同激素配比培養(yǎng)基對(duì)峨眉大黃姜莖尖分化成芽的影響

將體視顯微鏡下剝離的莖尖培養(yǎng)在不同激素配比的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)18 d左右開(kāi)始出現(xiàn)愈傷組織，27 d左右莖尖基部膨大（圖1）。30 d后觀察其成活率，60 d后觀察成芽率，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。峨眉大黃姜莖尖在3號(hào)培養(yǎng)基中的成活率最高，達(dá)100%，但成芽率僅為60.0%，并且在莖尖與培養(yǎng)基的接觸面形成大量愈傷，生長(zhǎng)速度較快； 2號(hào)培養(yǎng)基成活率其次，成活率為93.3%，成芽率最高，達(dá)83.3%，無(wú)愈傷形成，莖尖膨大伸長(zhǎng)、生長(zhǎng)速度較快；1號(hào)培養(yǎng)基的成芽率最低，為46.7%，莖尖基部膨大有少量愈傷形成，生長(zhǎng)速度較慢；4號(hào)培養(yǎng)基中莖尖的成活率低于其他處理組，成芽率比2號(hào)培養(yǎng)基低，但莖尖與培養(yǎng)基的接觸面與3號(hào)一樣也形成大量愈傷且生長(zhǎng)速度較快。因此采用2號(hào)培養(yǎng)基對(duì)峨眉大黃姜莖尖進(jìn)行培養(yǎng)效果較好。

表1不同激素配比對(duì)莖尖成活率及成芽率的影響

培養(yǎng)基號(hào)成活率（%）成芽率（%）186.7 46.7 293.3 83.3 3100.0 60.0 480.076.7

2.2不同激素配比對(duì)峨眉大黃姜叢生芽誘導(dǎo)的影響

選取生長(zhǎng)狀況良好且相對(duì)一致的脫毒苗分別接入不同激素配比叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。7號(hào)培養(yǎng)基誘導(dǎo)的叢生芽分化快、生長(zhǎng)旺盛、芽數(shù)最多且健壯，叢生芽誘導(dǎo)率為92.5%，誘導(dǎo)效果最佳；6號(hào)培養(yǎng)基誘導(dǎo)的叢生芽芽數(shù)為8.4個(gè)/株，生長(zhǎng)較快，芽色淺綠，但芽較纖細(xì)，叢生芽誘導(dǎo)率為85.7%，誘導(dǎo)效果次之；10號(hào)培養(yǎng)基誘導(dǎo)產(chǎn)生的叢生芽分化慢、芽量少且植株細(xì)弱，叢生芽誘導(dǎo)率為56.2%，誘導(dǎo)效果最差。因此，選擇7號(hào)培養(yǎng)基為峨眉大黃姜叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基，培養(yǎng)30 d后，產(chǎn)生的叢生芽見(jiàn)圖2。表2不同激素配比對(duì)峨眉大黃姜莖尖脫毒苗分化出叢生芽的影響

培養(yǎng)基號(hào)叢生芽誘導(dǎo)率

（%）平均芽數(shù)

（個(gè)/株）試管苗生長(zhǎng)情況575.43.5芽數(shù)較少、淺綠色、纖細(xì)、生長(zhǎng)較快685.78.4芽數(shù)較多、淺綠色、較纖細(xì)、生長(zhǎng)快792.512.4芽數(shù)多、綠色、較健壯、生長(zhǎng)快866.55.6芽數(shù)較少、黃綠色、較健壯、生長(zhǎng)較快972.44.6芽數(shù)少、黃綠色、較纖細(xì)、生長(zhǎng)較慢1056.23.1芽數(shù)少、黃綠色、較纖細(xì)、生長(zhǎng)慢

2.3試管苗根的誘導(dǎo)

選取生長(zhǎng)狀況基本一致且生長(zhǎng)良好的叢生芽，分成單芽后接入誘導(dǎo)生根的培養(yǎng)基中。每個(gè)培養(yǎng)瓶接種3個(gè)單芽，每組接種10個(gè)培養(yǎng)瓶，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。5種培養(yǎng)基的生根誘導(dǎo)率均為100%。其中15號(hào)培養(yǎng)基平均根數(shù)17.6條，根量最

表3不同激素配比對(duì)峨眉大黃姜叢生芽誘導(dǎo)生根的影響

培養(yǎng)基號(hào)生根誘導(dǎo)率

（%） 平均根數(shù)

（條）根生長(zhǎng)情況1110012.9根量一般、較粗壯1210011.7根量少、纖弱1310012.0根量一般、較纖弱1410016.3根量較多、較粗壯1510017.6根量多、粗壯發(fā)達(dá)

多，且粗壯發(fā)達(dá)，根生長(zhǎng)情況良好；其次為14號(hào)培養(yǎng)基，平均根數(shù)為16.3條，根量較多，根較粗壯，根的生長(zhǎng)情況較15號(hào)培養(yǎng)基略差；12號(hào)培養(yǎng)基平均根數(shù)為11.7條，根量少且根纖弱。試驗(yàn)結(jié)果表明，15號(hào)培養(yǎng)基為最佳誘導(dǎo)生根的激素配比。使用15號(hào)培養(yǎng)基誘導(dǎo)叢生芽生根，培養(yǎng)25 d后的誘導(dǎo)生根約1.5 cm（圖3）。

將生根成功后的組培苗接種到基質(zhì)培養(yǎng)基中，在大棚中進(jìn)行煉苗，培養(yǎng)10 d后，成活率可達(dá)90%以上，移栽成活的組培苗見(jiàn)圖4。

3結(jié)論與討論

在姜莖尖的離體培養(yǎng)中不同激素配比對(duì)其成活率、成芽率及生長(zhǎng)狀態(tài)的影響是一個(gè)極為重要的環(huán)節(jié)[5-8]。試驗(yàn)結(jié)果表明，MS+6-BA 0.1 mg/L+NAA 0.05 mg/L+GA3 0.3 mg/L為誘導(dǎo)莖尖的最佳激素配比，莖尖誘導(dǎo)的成活率為93.3%，成芽率為83.3%。本結(jié)論與周慶紅等在姜莖尖脫毒培養(yǎng)研究得出的研究結(jié)果[9]不一致，成活率和成芽率與其研究結(jié)果相比均有所提高。王桂梅等認(rèn)為在加入外源激素6-BA和NAA時(shí)，都能誘導(dǎo)莖尖萌動(dòng)和愈傷組織產(chǎn)生，但添加GA3后可提高莖尖的生長(zhǎng)速度和成芽率[10]。

本研究峨眉大黃姜叢生芽誘導(dǎo)最佳增殖培養(yǎng)基為MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L時(shí)，叢生芽的數(shù)目較多，平均數(shù)達(dá)12.4個(gè)，出芽率為92.5%，且生長(zhǎng)健壯，本結(jié)論與黃遠(yuǎn)新等的生姜莖尖離體培養(yǎng)研究結(jié)果[11]不一致，原因可能是姜的不同品種間及發(fā)育狀態(tài)可能存在一定差異，導(dǎo)致其葉片內(nèi)的內(nèi)源激素水平以及對(duì)外源激素的敏感性不同[12]，從而對(duì)相似激素配比的反應(yīng)有較大差異，這不僅表現(xiàn)在對(duì)叢生芽的誘導(dǎo)上，對(duì)莖尖、生根等的誘導(dǎo)同樣會(huì)產(chǎn)生影響。

生根培養(yǎng)結(jié)果，生根培養(yǎng)基為MS+IBA 0.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L時(shí)誘導(dǎo)效果最好，生根率為100%，平均生根數(shù)達(dá)17.6條，即IBA與NAA配合使用的誘導(dǎo)生根效果更好。當(dāng)只用1種激素時(shí)，NAA誘導(dǎo)生根效果優(yōu)于IBA。這與潘學(xué)峰等的研究結(jié)論[13]有所差異，本試驗(yàn)11號(hào)培養(yǎng)基（MS+NAA 0.5 mg/L）為最佳生根培養(yǎng)基，本結(jié)論與杭玲等對(duì)生姜莖尖離體培養(yǎng)研究得出的結(jié)論[14]相似，他們認(rèn)為IBA或NAA均可進(jìn)行生根誘導(dǎo)，但配合使用效果更佳。

峨眉大黃姜莖尖離體培養(yǎng)及植株再生的影響因子中，不同組合的激素配比起著非常重要的作用。試驗(yàn)中選擇了利用莖尖成芽后直接誘導(dǎo)叢生芽成苗，然后再進(jìn)行根的誘導(dǎo)，簡(jiǎn)化了培養(yǎng)步驟，縮短了整個(gè)培養(yǎng)周期，能很好保持植株的優(yōu)良性狀，有效提高了莖尖脫毒快繁的速度，降低了生產(chǎn)成本，更有利于脫毒苗的工廠化生產(chǎn)。

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