峨眉大黃姜的莖尖脫毒與植株再生

張玨等

摘要：為提高姜莖尖成苗率及試管苗的增殖效率，以峨眉大黃姜為供試材料，以MS為基礎培養基，研究了不同激素配比對峨眉大黃姜莖尖成芽率、試管苗增殖率、生根效果的影響。試驗結果表明，激素配比為MS+6-BA 0.1 mg/L+NAA 0.05 mg/L+GA3 0.3 mg/L 時，誘導莖尖成芽效果最好，成芽率為83.3%。脫毒苗叢生芽誘導最佳激素配比為：MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L，誘導率為92.5%，平均芽數為12.4個；生根效果激素配比以MS+IBA 0.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L為最佳，誘導率為100%，平均生根數為17.6條。

關鍵詞：峨眉大黃姜；莖尖脫毒；激素配比；植株再生

中圖分類號： S632.504文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2015）09-0077-03

收稿日期：2014-11-19

基金項目：四川省教育廳科研項目（編號：13ZB0342）；成都學院人才工程科研啟動項目（編號：20819031）。

作者簡介：張玨（1976—），女，四川成都人，博士，講師，主要從事藥用植物資源開發及利用研究。Tel：（028）84616308；E-mail： zhangjue@cdu.edu.cn。

通信作者：王躍華，教授，主要從事藥用植物資源開發及利用研究。E-mail：wangyaohua888@yahoo.com.cn。姜（Zingiber officinale Rosc）[1]為姜科姜屬多年生宿根草本植物。姜科植物姜的根莖，形如掌狀，它含有揮發油、姜辣素、黃酮類、酚類等物質及多種氨基酸[2]，是一種用途廣泛的藥食兼用植物。近年來，隨著食療保健在全世界范圍的興起，各國食品、醫藥、生物學家對姜的研究日益廣泛，姜在食品工業中的開發前景廣闊。人們已經對姜的成分、藥理、栽培技術和快速繁殖等方面有了較多的研究。姜以根狀莖作為繁殖材料，繁殖系數低，容易通過種姜傳播病害而且長期無性繁殖造成種性退化。1977年Hosoki等首先進行姜組織培養的研究[3]，迄今為止，在脫毒快繁、花器官培養、體細胞胚胎發生、器官發生、原生質體培養和種質保存等方面取得了一定進展[4]。目前對姜的莖尖脫毒及植株再生研究較多，但對于較有四川特色的峨眉大黃姜的莖尖脫毒及離體快繁還未見報道。本試驗通過對峨眉大黃姜的莖尖剝離和離體培養來快速繁殖姜脫毒種苗，研究不同濃度激素配比對莖尖的成苗率、叢生芽誘導率、生根的影響，以期篩選出大黃姜繁殖速度快、縮短培養周期、建立快繁技術體系的最佳激素配比，為解決峨眉大黃姜品種退化問題和實現脫毒種苗的規模化、工廠化生產奠定基礎。

1材料與方法

1.1材料

峨眉大黃姜的根狀莖由四川農業大學農學院藥用植物園惠贈。

1.2方法

1.2.1外植體的獲取及消毒精選塊大、皮色黃亮、無病蟲危害的健壯根狀莖作為外植體，洗凈表面泥土后，用50%多菌靈可濕性粉劑800倍液對其進行消毒15 min，置于（37±2）℃條件下恒溫培養箱熱處理28 d鈍化病毒，待姜芽長至10～2.5 cm時，將姜芽掰下，用自來水沖洗1～2 h，移入接種室。在超凈工作臺上剝去姜芽表層葉片，用75%乙醇消毒 20 s，用無菌水沖洗3次，再用0.1%氯化汞消毒10 min后，用無菌水洗5次，用無菌濾紙吸干表面水分，體視顯微鏡下用解剖針剝離莖尖（約0.3～0.5 mm）并將其接種于誘導培養基上。

1.2.2莖尖離體培養以MS培養基為基礎培養基，添加不同濃度激素，研究不同濃度配比對莖尖分化成苗的影響。主要采用不同濃度GA3和6-BA進行試驗設計，GA3濃度為0.1、0.3 mg/L，6-BA濃度為0.1、0.2 mg/L，并結合 005 mg/L NAA作為莖尖培養的培養基，每處理10個莖尖，重復3次。各處理培養基配方分別為： （1）：MS+0.05 mg/L NAA+0.1 mg/L 6-BA+0.1 mg/L GA3；（2）：MS+0.05 mg/L NAA+0.1 mg/L 6-BA+0.3 mg/L GA3；（3）：MS+ 0.05 mg/L NAA+0.2 mg/L 6-BA+0.1 mg/L GA3；（4）：MS+0.05 mg/L NAA+0.2 mg/L 6-BA+0.3 mg/L GA3。將姜莖尖接種至上述培養基中，黑暗培養，每3 d觀察1次，待莖尖伸長膨大后，置于光照度為1 800～2 000 lx、光照時數14 h/d、溫度26 ℃條件下進行培養，每3 d觀察1次，60 d 后統計成活率，80 d后統計成苗率，比較各處理的成活率、成芽率的差異。待莖尖成苗后，繁殖到一定量剪其葉片進行病毒檢測（酶聯免疫吸附法），經檢測合格后進行繼代培養。

1.2.3脫毒苗叢生芽誘導增殖培養將病毒檢測合格的脫毒苗轉接于含不同濃度激素配比的MS快繁誘導培養基中進行培養，篩選最佳增殖培養基配方。各處理的培養基配方分別為：（5）：MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.05 mg/L； （6）：MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L；（7）：MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L；（8）：MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.05 mg/L；（9）：MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L；（10）：MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L。每處理接種5瓶，每瓶6苗，重復3次。每5 d觀察1次，比較不同激素配比對姜脫毒苗叢生芽誘導增殖效率的影響，并篩選最佳誘導培養基。

1.2.4根的誘導將苗高3 cm左右的叢生芽分成單株，轉入不同濃度激素配比的1/2MS生根培養基。生根培養基配方分別為：（11）： 1/2MS+0.5 mg/L NAA；（12）： 1/2MS+1.0 mg/L NAA；（13）： 1/2MS+0.1 mg/L IBA；（14）： 1/2MS+0.5 mg/L IBA；（15）： 1/2MS+0.1 mg/L IBA+0.5 mg/L NAA。培養基中加入3.0%蔗糖、0.45%瓊脂、0.2%活性炭，pH值5.6～5.8。每處理接種10瓶，每瓶3苗，重復3次。每7 d觀察1次，比較不同激素配比對姜組培苗生根的影響，并篩選最適生根培養基。最后將生根誘導成功的組培苗移栽到基質中，在大棚中進行煉苗，培養10 d后，統計成活率。

2結果與分析

2.1不同激素配比培養基對峨眉大黃姜莖尖分化成芽的影響

將體視顯微鏡下剝離的莖尖培養在不同激素配比的培養基中，培養18 d左右開始出現愈傷組織，27 d左右莖尖基部膨大（圖1）。30 d后觀察其成活率，60 d后觀察成芽率，試驗結果見表1。峨眉大黃姜莖尖在3號培養基中的成活率最高，達100%，但成芽率僅為60.0%，并且在莖尖與培養基的接觸面形成大量愈傷，生長速度較快； 2號培養基成活率其次，成活率為93.3%，成芽率最高，達83.3%，無愈傷形成，莖尖膨大伸長、生長速度較快；1號培養基的成芽率最低，為46.7%，莖尖基部膨大有少量愈傷形成，生長速度較慢；4號培養基中莖尖的成活率低于其他處理組，成芽率比2號培養基低，但莖尖與培養基的接觸面與3號一樣也形成大量愈傷且生長速度較快。因此采用2號培養基對峨眉大黃姜莖尖進行培養效果較好。

表1不同激素配比對莖尖成活率及成芽率的影響

培養基號成活率（%）成芽率（%）186.7 46.7 293.3 83.3 3100.0 60.0 480.076.7

2.2不同激素配比對峨眉大黃姜叢生芽誘導的影響

選取生長狀況良好且相對一致的脫毒苗分別接入不同激素配比叢生芽誘導培養基中，試驗結果見表2。7號培養基誘導的叢生芽分化快、生長旺盛、芽數最多且健壯，叢生芽誘導率為92.5%，誘導效果最佳；6號培養基誘導的叢生芽芽數為8.4個/株，生長較快，芽色淺綠，但芽較纖細，叢生芽誘導率為85.7%，誘導效果次之；10號培養基誘導產生的叢生芽分化慢、芽量少且植株細弱，叢生芽誘導率為56.2%，誘導效果最差。因此，選擇7號培養基為峨眉大黃姜叢生芽誘導培養基，培養30 d后，產生的叢生芽見圖2。表2不同激素配比對峨眉大黃姜莖尖脫毒苗分化出叢生芽的影響

培養基號叢生芽誘導率

（%）平均芽數

（個/株）試管苗生長情況575.43.5芽數較少、淺綠色、纖細、生長較快685.78.4芽數較多、淺綠色、較纖細、生長快792.512.4芽數多、綠色、較健壯、生長快866.55.6芽數較少、黃綠色、較健壯、生長較快972.44.6芽數少、黃綠色、較纖細、生長較慢1056.23.1芽數少、黃綠色、較纖細、生長慢

2.3試管苗根的誘導

選取生長狀況基本一致且生長良好的叢生芽，分成單芽后接入誘導生根的培養基中。每個培養瓶接種3個單芽，每組接種10個培養瓶，試驗結果見表3。5種培養基的生根誘導率均為100%。其中15號培養基平均根數17.6條，根量最

表3不同激素配比對峨眉大黃姜叢生芽誘導生根的影響

培養基號生根誘導率

（%） 平均根數

（條）根生長情況1110012.9根量一般、較粗壯1210011.7根量少、纖弱1310012.0根量一般、較纖弱1410016.3根量較多、較粗壯1510017.6根量多、粗壯發達

多，且粗壯發達，根生長情況良好；其次為14號培養基，平均根數為16.3條，根量較多，根較粗壯，根的生長情況較15號培養基略差；12號培養基平均根數為11.7條，根量少且根纖弱。試驗結果表明，15號培養基為最佳誘導生根的激素配比。使用15號培養基誘導叢生芽生根，培養25 d后的誘導生根約1.5 cm（圖3）。

將生根成功后的組培苗接種到基質培養基中，在大棚中進行煉苗，培養10 d后，成活率可達90%以上，移栽成活的組培苗見圖4。

3結論與討論

在姜莖尖的離體培養中不同激素配比對其成活率、成芽率及生長狀態的影響是一個極為重要的環節[5-8]。試驗結果表明，MS+6-BA 0.1 mg/L+NAA 0.05 mg/L+GA3 0.3 mg/L為誘導莖尖的最佳激素配比，莖尖誘導的成活率為93.3%，成芽率為83.3%。本結論與周慶紅等在姜莖尖脫毒培養研究得出的研究結果[9]不一致，成活率和成芽率與其研究結果相比均有所提高。王桂梅等認為在加入外源激素6-BA和NAA時，都能誘導莖尖萌動和愈傷組織產生，但添加GA3后可提高莖尖的生長速度和成芽率[10]。

本研究峨眉大黃姜叢生芽誘導最佳增殖培養基為MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L時，叢生芽的數目較多，平均數達12.4個，出芽率為92.5%，且生長健壯，本結論與黃遠新等的生姜莖尖離體培養研究結果[11]不一致，原因可能是姜的不同品種間及發育狀態可能存在一定差異，導致其葉片內的內源激素水平以及對外源激素的敏感性不同[12]，從而對相似激素配比的反應有較大差異，這不僅表現在對叢生芽的誘導上，對莖尖、生根等的誘導同樣會產生影響。

生根培養結果，生根培養基為MS+IBA 0.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L時誘導效果最好，生根率為100%，平均生根數達17.6條，即IBA與NAA配合使用的誘導生根效果更好。當只用1種激素時，NAA誘導生根效果優于IBA。這與潘學峰等的研究結論[13]有所差異，本試驗11號培養基（MS+NAA 0.5 mg/L）為最佳生根培養基，本結論與杭玲等對生姜莖尖離體培養研究得出的結論[14]相似，他們認為IBA或NAA均可進行生根誘導，但配合使用效果更佳。

峨眉大黃姜莖尖離體培養及植株再生的影響因子中，不同組合的激素配比起著非常重要的作用。試驗中選擇了利用莖尖成芽后直接誘導叢生芽成苗，然后再進行根的誘導，簡化了培養步驟，縮短了整個培養周期，能很好保持植株的優良性狀，有效提高了莖尖脫毒快繁的速度，降低了生產成本，更有利于脫毒苗的工廠化生產。

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