樹突狀細胞疫苗聯合抗CD27抗體治療前列腺癌的實驗研究

費金璇　吳宇佳　周　莉　朱晟鑫　廖偉斌　韋思明

·論著·

樹突狀細胞疫苗聯合抗CD27抗體治療前列腺癌的實驗研究

費金璇吳宇佳周莉朱晟鑫廖偉斌韋思明★

目的 探討抗CD27抗體對樹突狀細胞疫苗的抗前列腺癌功效的影響。方法 將RM-1前列腺癌細胞注入雄性C57BL/6小鼠皮下。4d后，將載瘤小鼠分為4組，分別接受未治療、樹突狀細胞疫苗治療、抗CD27抗體治療及樹突狀細胞疫苗聯合抗CD27抗體治療。腫瘤細胞移植后21d，收集小鼠脾臟，分析T細胞活性。測量腫瘤大小，評價抗腫瘤效應。結果 相比于未治療，其它3種治療均明顯提高了T細胞活性，顯著抑制了腫瘤生長，尤其以聯合治療的功效最明顯。結論 聯合治療通過提高T細胞活性加強了抗前列腺癌效應。

抗CD27抗體 樹突狀細胞疫苗 前列腺癌

在西方發達國家，前列腺癌是男性最常見的腫瘤，也是腫瘤死亡的第二位病因［1］。前列腺癌一旦轉移，化、放療等方法效果均不理想。用樹突狀細胞疫苗治療晚期前列腺癌是一種新型的治療方法，有效率達54%［2］。如何加強疫苗的治療效果已成為研究的重要方向。作者自2014年1月至6月探索抗CD27抗體是否能提高樹突狀細胞疫苗的抗前列腺癌功效。報道如下。

1　材料與方法

1.1材料 6～8周齡的雄性C57BL/6小鼠購自上海實驗動物中心。小鼠前列腺癌細胞株RM-1來源于上海細胞研究所。粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子、腫瘤壞死因子α、白細胞介素4、干擾素γ由R&D Systems公司生產。T細胞分離試劑盒購于Miltenyi Biotec公司。異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）標記的抗CD3、CD11c單抗，藻紅蛋白（phycoerythrin，PE）標記的抗CD27、CD83單抗，抗CD27單克隆抗體，及測定干擾素γ的試劑盒系BD PharMingen公司產品。鉻酸鈉由PerkinElmer公司生產。

1.2制作樹突狀細胞疫苗 從C57BL/6小鼠中分離出骨髓細胞，與粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子、白細胞介素4等一起培養。第7天，骨髓細胞分化為未成熟樹突狀細胞，然后與RM-1前列腺癌細胞溶解產物（即腫瘤抗原）、腫瘤壞死因子α、干擾素γ等一起培養。24h后，未成熟樹突狀細胞分化為成熟樹突狀細胞（即樹突狀細胞疫苗），也就是上載腫瘤抗原的樹突狀細胞。通過表型分析證實培養的細胞是樹突狀細胞。

1.3分析樹突狀細胞表型 收集未成熟或成熟樹突狀細胞，用FITC標記的抗CD11c（樹突狀細胞標志）單抗和PE標記的抗CD83（樹突狀細胞成熟標志）單抗染色，用流式細胞儀分析CD11c和CD83在細胞上的表達。

1.4分析T細胞上CD27的表達 C57BL/6小鼠未接種樹突狀細胞疫苗或者皮下接種樹突狀細胞疫苗（1×106）。3d后，處死小鼠，獲取脾臟。用T細胞分離試劑盒從脾細胞中分離出T細胞，然后用FITC標記的抗CD3（T細胞標志）單抗和PE標記的抗CD27單抗染色，流式細胞儀分析T細胞表面CD27的表達。1.5 腫瘤接種及治療 將2×105個RM-1前列腺癌細胞注射到C57BL/6小鼠的右側肋腹皮下。4d后，將載瘤小鼠隨機分為4組，每組10只。對照組未接受治療。疫苗治療組于載瘤后第4天和第11天，將樹突狀細胞疫苗（1×106）接種于小鼠左側肋腹皮下。抗體治療組于載瘤后第4天和第11天，將100μg抗CD27抗體注射到小鼠腹腔內。聯合治療組小鼠在第4天和11天接受疫苗（1×106）皮下注射，在第7天和14天，接受抗CD27抗體（100μg）腹腔內注射。載瘤第21天，處死小鼠，獲取脾臟，測量腫瘤大小。

1.6細胞毒性試驗 用CD8+T細胞分離試劑盒從脾細胞中分離出CD8+T細胞，以10：1的比例與樹突狀細胞疫苗混合培養。5d后，收獲致敏的CD8+T細胞。RM-1前列腺癌細胞作為靶細胞，與鉻酸鈉混合培養60min，以便標記上鉻。致敏的CD8+T細胞作為效應細胞，以100：1的比例與鉻標記的RM-1前列腺癌細胞（即靶細胞）混合培養。4h后，收集上清液，測量鉻的釋出量。通過公式［（實驗組鉻釋出量－自發鉻釋出量）/（最大鉻釋出量－自發鉻釋出量）］×100，計算出CD8+T細胞對前列腺癌細胞的殺傷率。

1.7干擾素γ的測定 用CD4+T細胞分離試劑盒從脾細胞中分離出CD4+T細胞，以10：1的比例與樹突狀細胞疫苗混合培養24h。收集上清液，用酶聯免疫吸附試驗測定干擾素γ水平。

1.8統計學方法 采用GraphPad Prism 4.0統計軟件。數據以（x±s）表示。組間數據比較采用單因素方差分析和q檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1樹突狀細胞表面標志 在未成熟樹突狀細胞，CD11c和CD83的表達率分別是83.2%（即3.4%+79.8%）和3.4%；在成熟樹突狀細胞（即樹突狀細胞疫苗），CD11c和CD83的表達率分別是84.1%（即66.7%+17.4%）和66.7%（見圖1）。由此可見，所有培養的細胞高表達CD11c（樹突狀細胞標志），這表明培養的細胞是樹突狀細胞。相比于未成熟樹突狀細胞，成熟的樹突狀細胞表達更高水平的CD83（樹突狀細胞成熟標志）。

圖1　流式細胞儀分析CD11c和CD83在樹突狀細胞上的表達

2.2用樹突狀細胞疫苗接種小鼠后，上調了T細胞上CD27的表達 在未接種樹突狀細胞疫苗的小鼠，僅7.2%的T細胞表達CD27；然而，用樹突狀細胞疫苗接種小鼠后第3天，47.5%的T細胞表達了CD27（見圖2）。

2.3三種治療方法對腫瘤大小、CD8+T細胞的殺傷率及CD4+T細胞產生干擾素γ水平的影響 見表1。

表 1 各組腫瘤大小、殺傷率及干擾素γ水平的比較（x±s）

圖2　流式細胞儀分析CD27在T細胞上的表達

3　討論

樹突狀細胞是體內功能最強的抗原遞呈細胞，能處理和遞呈腫瘤抗原給CD4+和CD8+T細胞，刺激T細胞活化［3，4］。活化的CD8+T細胞能直接殺死腫瘤細胞［5］。活化的CD4+T細胞能釋放細胞因子，如干擾素γ，幫助CD8+T細胞活化［6］。靜息的T細胞低表達CD27，然而，一旦T細胞活化，CD27表達明顯升高［7］。抗CD27抗體與CD27結合為T細胞的活化提供協同刺激信號，進一步提高T細胞的功能［8］。本實驗結果顯示，用樹突狀細胞疫苗接種小鼠后，T細胞上調了CD27表達，這為抗CD27抗體的應用提供了理論依據。此外，作者發現，相比于疫苗或抗體的單一治療，聯合治療顯著抑制了腫瘤生長，表明抗CD27抗體加強了疫苗的抗前列腺癌功效。本實驗還顯示，聯合治療組的殺傷率和干擾素γ水平明顯高于單一治療組，這表明聯合治療提高了T細胞活性。在本試驗中，作者使用了成熟樹突狀細胞（即樹突狀細胞疫苗）治療前列腺癌。相比于未成熟樹突狀細胞，成熟樹突狀細胞能誘導更強的抗腫瘤免疫反應，產生更好的臨床效果［2］，表達更高水平的CD83（樹突狀細胞成熟標志）。

綜上所述，樹突狀細胞疫苗聯合抗CD27抗體通過提高T細胞活性來加強抗前列腺癌功效。這為臨床上治療前列腺癌提供了良好的實驗基礎和理論依據。

1 Siegel R,Naishadham D,Jemal A. Cancer statistics,CA Cancer J Clin,2012, 62（1）：10～29.

2 Draube A,Klein-González N,Mattheus S,et al.Dendritic cell based tumor vaccination in prostate and renal cell cancer： a systematic review and meta-analysis.PLoS One,2011,6（4）：e18801.

3 Mantia-Smaldone GM,Chu CS. A review of dendritic cell therapy for cancer： progress and challenges. BioDrugs,2013,27（5）：453～468.

4 Agarwal N,Padmanabh S,Vogelzang NJ. Development of novel immuneinterventions for prostate cancer. Clin Genitourin Cancer,2012, 10（2）：84～92.

5 Xiao L,Joo KI,Lim M,et al. Dendritic cell-directed vaccination with a lentivector encoding PSCA for prostate cancer in mice.PLoS One, 2012,7（11）：e48866.

6 Shafer-Weaver KA,Watkins SK,Anderson MJ,et al. Immunity to murine prostatic tumors： continuous provision of T-cell help prevents CD8 T-cell tolerance and activates tumor-infiltrating dendritic cells. Cancer Res,2009,69（15）：6256～6264.

7 Taraban VY,Rowley TF,Kerr JP,et al. CD27 costimulation contributes substantially to the expansion of functional memory CD8（+）T cells after peptide immunization. Eur J Immunol,2013,43（12）：3314～3323.

8 Roberts DJ,Franklin NA,Kingeter LM,et al.Control of established melanoma by CD27 stimulation is associated with enhanced effector function and persistence,and reduced PD-1 expression of tumor infiltrating CD8（+）T cells. J Immunother,2010,33（8）：769～779.

Objective To investigate whether anti-CD27 antibody can enhance anti-prostate cancer effi cacy of dendritic cell-based vaccine. Methods A prostate cancer model was established by subcutaneous injection of RM-1 prostate cancer cells into male C57BL/6 mice. After 4 days，prostate cancer-bearing mice underwent untreatment or were treated with dendritic cell-based vaccine，anti-CD27 antibody，or combination of dendritic cell-based vaccine with anti-CD27 antibody. Spleens were collected for analysis of T cell activity 21 days after tumor cell implantation. Tumor size was measured for assessment of antitumor effect. Results Three treatments signifi cantly enhanced T-cell activity，and signifi cantly reduced tumor growth compared with untreatment，with the highest effi cacy in combination treatment. Conclusion Combined treatment can strengthen anti-prostate cancer effi cacy by improving T-cell activity.

Anti-CD27 antibody Dendritic cell-based vaccine Prostate cancer

2014年浙江省大學生科技創新活動計劃（新苗人才計劃）（2014R434009）；2014年浙江省醫藥衛生科技計劃項目（2014KYA051）

310053 浙江醫學高等專科學校