外周血中性粒細胞凋亡相關蛋白質對SAP的誘導凋亡機制研究

秦斯敏　譚建榮　羅顯克　王大東

外周血中性粒細胞凋亡相關蛋白質對SAP的誘導凋亡機制研究

秦斯敏譚建榮羅顯克王大東

目的 探討外周血中性粒細胞凋亡相關蛋白質及生長抑素在重癥急性胰腺炎（SAP）時的誘導凋亡機制。方法 將90只SD大鼠編號，隨機分為重癥急性胰腺炎組（SAP組）和假手術組（SO組），每組45只，使用TUNEL熒光標記法、免疫組織化學法、RT-PCR法分別檢測大鼠的外周血中性粒細胞凋亡情況、中性粒細胞survivin蛋白表達情況和中性粒細胞survivin mRNA的表達情況，分析比較兩組的檢測結果。結果 SAP組與SO組比較，24h、48h、72h三個時點中性粒細胞凋亡率呈現明顯的下降（P＜0.05），SO組各時點中性粒細胞凋亡率差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；SO組和SAP組大鼠外周血中性粒細胞survivin蛋白均有表達，SAP組大鼠24h、48h、72h三個時點表達明顯高于SO組各相應時點（P＜0.05），SO組各時點中性粒細胞survivin 蛋白均有表達，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；SO組和SAP組中性粒細胞survivin mRNA有表達，但SAP組24h、48h、72h組中性粒細胞survivin mRNA表達明顯高于SO組（P＜0.05），SO組各時點中性粒細胞survivin蛋白均有表達，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。結論 中性粒細胞的凋亡與SAP發(fā)展有密切關系，能遏制其進一步發(fā)展，改善患者預后。Survivin與中性粒細胞凋亡延遲有關，對其起到調控作用。

中性粒細胞 凋亡 重癥急性胰腺炎

重癥急性胰腺炎（SAP）是消化內科常見急性病，該病起病急，病情變化迅速，嚴重威脅患者生命和身心健康。外周血中性粒細胞激活與患者SAP的發(fā)展惡化有密切的聯系，中性粒細胞凋亡的延緩與炎性反應持續(xù)及繼發(fā)組織損傷有關。近年研究證實細胞凋亡參與了SAP病理生理過程［1］。中性粒細胞凋亡的延緩可能是胰腺炎引起的全身炎癥反應及多臟器衰竭發(fā)展的機制之一。本文旨在研究外周血中性粒細胞凋亡相關蛋白質及生長抑素在SAP時的誘導凋亡機制。

1　材料與方法

1.1一般資料 選取清潔級、雌雄不限、體重300～350g的健康成年SD大鼠共90只，由廣西醫(yī)科大學實驗動物中心提供。給所有大鼠進行編號，按照拋硬幣法隨機分為假手術組（SO組）和SAP組，各45只，其中SO組45只大鼠按照隨機數字表法進一步隨機分為24h、48h、72h三個時點，每個時點15只。SAP組45只大鼠進一步隨機分為24h、48h、72h三個時點，各時點15只。所有大鼠分組后均衡性比較好，收集每個組存活大鼠的外周靜脈血樣，然后立即將大鼠處死并留取大鼠胰腺組織器官。

1.2方法 （1）SAP組：首先建立SAP模型，具體操作過程如下：取2%戊巴比妥鈉（40mg/kg）麻醉大鼠，采用腹腔內注射麻醉方法待完全麻醉后，在大鼠腹壁消毒，然后使用外科手術刀在消毒腹壁正中切開，切口長度1.5～2.0cm。用無損傷顯微手術鑷子夾出十二指腸，尋找肝十二指腸韌帶，翻開右緣可找到透明的膽總管。使用外科鑷子小心分離一段大約4cm的膽總管備用，另使用無損傷顯微手術血管夾阻斷肝門下方的膽總管，隨后順著分離的膽總管向下，選擇膽胰管匯入十二指腸距末端0.5cm處鈍性剝離膽胰管約0.5cm，便于穿刺。在手術顯微視野下使用24號小兒套管針逆行穿刺，待針插入約1.0cm后，立即拔出針芯，為防止藥液倒流，可使用套上細乳膠管的顯微血管鉗夾置于穿刺點。將裝有4%牛磺膽酸鈉的微量輸液泵的注射器連接到套管針的尾部。微量泵輸入速度0.1ml/min、劑量1ml/kg，完成注射后在5min內拔出套管針，解除肝門部的阻斷措施，為防止膽汁漏出可使用生物膠涂抹在針眼處，最后進行雙層縫合腹壁。（2）SO組：接受類似SAP組的手術。切開1.5～2.0cm的切口，然后找到十二指腸，對胰腺進行翻動，不予任何措施，最后關閉腹腔。每組大鼠進行手術后予皮下注射0.9%氯化鈉注射液2ml，防止大鼠在手術過程中丟失大量水分。所有大鼠手術后不禁水，控制室內溫度20～25℃。使用TUNEL熒光標記法、免疫組織化學法、RT-PCR法分別檢測大鼠的外周血中性粒細胞凋亡情況、中性粒細胞 survivin 蛋白表達情況和中性粒細胞survivin mRNA的表達情況。

1.3統(tǒng)計學方法 采用SPSS19.0軟件。計數資料以（±s）表示。計量資料組間比較采用t檢驗，采用重復測量進行趨勢分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結果

2.1外周血中性粒細胞凋亡變化 見表1。

表1　外周血中性粒細胞凋亡變化的比較（%，（x±s）

2.2外周血中性粒細胞survivin蛋白表達的變化 見表2。

表2　外周血中性粒細胞survivin蛋白表達的變化比較（x±s）

2.3外周血中性粒細胞survivin mRNA表達的變化 見表3。

表3　外周血中性粒細胞survivin mRNA表達的變化比較（x±s）

3　討論

造成SAP患者死亡的主要原因為多臟器器官功能衰竭，在眾多臟器中，肺衰竭發(fā)生的幾率是最高的，SAP并發(fā)肺損傷的發(fā)生率明顯升高，可達50%～70%。中性粒細胞是體內數量最多的炎性白細胞，能明顯影響機體的免疫系統(tǒng)，與機體免疫防衛(wèi)有密切的關系，但其對機體本身正常組織也有非常嚴重的損傷。SAP引起的炎性反應比較強烈，其消退與否與外周血中性粒細胞的凋亡情況有重要的關系。

SAP患者炎性反應持續(xù)及組織損傷與外周血中性粒細胞凋亡的延緩有關。中性粒細胞通過凋亡延遲或抑制使得其存活時間明顯延長，但也存在一個缺點，導致吞噬、殺傷等正常免疫功能喪失，僅能釋放一部分氧自由基和蛋白水解酶及其他有害內容物，這均能促進炎癥的加重和周圍組織的損傷，從而導致SAP遷延和進一步惡化［2］。為了探索SAP對外周血中性粒細胞凋亡的影響及發(fā)生機制，作者通過對SAP組和SO組大鼠外周血中性粒細胞進行體外培養(yǎng)，連續(xù)孵育16h［3］，分別觀察兩組大鼠外周血中心粒細胞凋亡發(fā)生情況。本資料結果顯示，SAP大鼠中性粒細胞體外培養(yǎng)16h自發(fā)性凋亡率明顯低于假手術組，提示SAP大鼠外周血中性粒細胞的自發(fā)凋亡受到明顯抑制，中性粒細胞壽命延長。另外，SO組大鼠外周血中性粒細胞survivin蛋白和mRNA表達較低或不表達。然而在SAP組大鼠中survivin蛋白和mRNA表達明顯升高，提示SAP外周血中性粒細胞凋亡延遲的調控與survivin表達有密切的關系［4］。SAP組大鼠外周血中性粒細胞凋亡明顯抑制了抑制蛋白survivin的高表達，提示可通過分子靶向方法抑制SAP組大鼠外周血中性粒細胞內的survivin的表達，從而控制和促進外周血中性粒細胞的凋亡程度，通過減少炎癥介質的釋放，可以有效阻遏SAP向SIRS、MODS等方向發(fā)展惡化，提高患者生存率［5，6］。

總之，外周血中性粒細胞凋亡與炎癥介質有密切的關系，在SAP的遷延、惡化的過程中發(fā)揮了重要的作用，通過控制中性粒細胞的凋亡可有效控制SAP的病情，并且中性粒細胞中survivin的高度表達，說明其參與了中性粒細胞凋亡的延遲調控。

1 Liu JJ,Akahoshi T,Namai R, et al. Efect of auranofin,an antirheumatic drug, on neutrophil apoptosis. Inflamm Res,2000,24（49）： 64～50

2 Fossati G,Moulding DA,Spiller DG,et al.The Mitochondrial network of human neutrophils：Role in chemotaxis,phagocytosis,respiratory burst activation,and commitment to apoptosis. J Immunol,2003,35（170）：1964～1972.

3 Ambudkar IS. Polarization of calcium signaling and fluid secretionin salivary gland cells. Curr Med Chem,2012,19（34）：5774～5781.

4 Tian R,Tan JT,Wang RL,et al.The role of intestinal mucosa oxidative stress in gut barrier dysfunction of severe acute pancreatitis.Eur Rev Med Pharmocol Sci,2013,17（3）：349～355.

5 陳誠,徐萍,王靜,等.PI3K抑制劑對急性胰腺炎細胞因子和組織病理學評分的影響.世界華人消化雜志,2012,20（36）：3663～3369.

6 Tamizhselvi R,Shrivastava P,Koh YH,et al. Preprotachykinin-Agene deletion regulates hydrogen sulfide induced toll-like receptor4 signaling pathway in cerulein-treated pancreatic acinar cells.Pancreas,2011, 40（3）：444～452.

Objective To investigate the mechanism of apoptosis induced by peripheral blood neutrophile granulocyte apoptosis related proteins and somatostatin in patients with severe acute pancreatitis. Method 90 SD rats were randomly divided into the severe acute pancreatitis group（SAP）and the sham operation group（SO），45 rats in each group，to detect the peripheral blood neutrophile granulocyte survivin expression，neutrophile granulocyte survivin protein expression and expression of neutrophil survivin mRNA by the Methods of TUNEL fl uorescence labeling method，immunohistochemical method and the RT-PCR method. Results SAP Group compared with SO group，24h，48h，72h three point neutrophil apoptosis rate decreased obviously（P＜0.05），the SO group at different time points of neutrophil apoptosis rate had no signifi cant difference（P＞0.05）；The peripheral blood neutrophils espressed survivin in two group，and the SAP group was higher than that in the SO group at the time of 24h，48h and 72h（P＜0.05），the peripheral blood neutrophils expressed survivin in SO group，there is no signifi cant difference（P>0.05），The peripheral blood neutrophils expressed survivin in two group，and the So group was higher than that in the SAP group at the time of 24h，48h and 72h（P<0.05），the peripheral blood neutrophils expressed survivin in SAP group，there is no signifi cant difference（P>0.05）. Conclusion There is a close relationship between neutrophil apoptosis and SAP development，to curb the further development，improve the prognosis of the patients. Survivin is plays a regulatory role in the delay of neutrophil apoptosis.

neutrophile granulocyte Apoptosis Severe acute pancreatitis

530001 廣西壯族自治區(qū)民族醫(yī)院消化內科