HBV感染后慢性化進展過程中miRNA表達HBV基因型 P基因點突變的研究

敖家富　冀文娟　張　靜　顧國浩蔣敏

HBV感染后慢性化進展過程中miRNA表達HBV基因型 P基因點突變的研究

敖家富冀文娟張靜顧國浩★蔣敏

目的 探討HBV感染引起的肝臟病變慢性化進展為慢性乙肝、肝硬化、肝癌之相關因素，分析各因素在肝臟病變慢性化演變過程中的作用及在診斷、治療、判斷預后中的應用價值。方法 采用xMAP液態芯片技術定量檢測HBV相關肝病標本中PBMCmiR-191、-223、-222、-145、-21、-31、-126、-20a、-372的表達水平；采用直接測序法檢測相應血清標本HBV基因型及P基因區耐藥位點突變；對HBV相關肝病慢性化進展的各可能相關因素包括性別、年齡、HBV基因型、HBV DNA載量水平、HBeAg狀態、miRNA表達水平作多因素Logistic回歸分析，探討參與HBV感染引起的肝臟病變慢性化演變過程的相關因素。結果 HBV C基因型、DNA載量持續高水平表達、miR-20a表達上調、miR-126及miR-223表達下調是在乙肝慢性化進展中有統計學意義的影響因素（P＜0.05），而HBeAg狀態、自然狀態下發生的耐藥相關位點突變，年齡、性別等因素差異無統計學意義（P>0.05）。結論 C基因型，HBV DNA持續高載量以及miR-126、-223低表達，miR-20a高表達可能是導致乙肝慢性化的相關因素，尤其可能是肝癌發生的危險因子，常規檢測基因型、HBV DNA及miRNA的定量檢測可為監測病情、判斷預后、及時治療預防乙肝慢性化進展提供資料。

HBV基因型 xMAP液態芯片 miRNA P基因突變

乙型病毒性肝炎是世界范圍的嚴重公共衛生問題之一，我國是乙肝感染大國，全國1～59歲人群乙肝表面抗原攜帶率為1.18%［1］，80%～90%的急性HBV感染者可發展為慢性乙型肝炎（CHB），其中20%～30%可發展為肝硬化（LC）或肝癌（HCC）。在我國約90%的肝細胞癌患者均合并HBV感染［2］。作者通過收集未曾服用核苷類抗病毒藥物的病例，采用直接測序法檢測HBV DNA P基因區部分序列并對其分型，將HBV基因型及P基因區自發耐藥相關突變、性別、年齡、HBV DNA載量水平、HBeAg狀態進行多因素Logistic回歸分析，探討參與HBV感染者肝病慢性化進展的相關因素。

1　材料與方法

1.1一般資料 收集蘇州大學附屬第一醫院及亳州市人民醫院2010年10月至2011年12月住院和門診HBV感染者169例，其中男126例，女43例；年齡（45.51±12.87）歲。其中急性乙型肝炎（AHB）患者40例、慢性乙型肝炎（CHB）患者53例、肝炎后肝硬化（LC）患者44例、HCC患者32例及健康對照（NC）40例，診斷符合2010年中華醫學會傳染病與寄生蟲分會、肝病學分會聯合修訂的“慢性乙型肝炎防治指南”診斷標準［3］，每例樣本采集外周血1ml，立即提取單個核細胞后抽提總RNA，并保存相應血清1ml -80℃低溫保存備用。

1.2方法 （1）主要試劑和儀器：天根病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒（天根）、Taq酶（TAKARA/ C，DR001B）、BigDye Terminatory3.1 Cycle（AB，4336913）、天根乙型肝炎病毒及耐藥突變檢測試劑盒（天根）、微球（Bio-Rad）、地址序列探針（上海生工）、1.5×TMAC緩沖液（Sigma）、Streptavidin R-phycoerythrin，conjugate（1mg/ml，INVITROGEN）、RNA-DNA嵌合探針（上海吉瑪生物）、Rnase A（sigma）、Thermo Spectronic紫外分光光度計（美國Spectronic）、MyCycler PCR擴增儀（Bio-Rad）、Luminex 200（Luminex）、 PCR儀為ABI9700、測序儀ABI3730XL、Light Cycler Real Time PCR擴增儀（Roche）。（2）液體芯片法檢測miRNA：將所有標本上PCR儀與嵌合探針進行雜交反應，經過微球雜交、酶切反應、熒光信號檢測，以miR-103為內參（取3次讀數平均值作為有效內參照數值），將標本的（靶miRNA分子平MFI-對應本底MFI）/（miR-103MFI 對應本底MFI）的比值作為有效數據進行分析。（3）HBV DNA定量測定：PCR反應體系及循環條件為HBV DNA提取液4μl，PCR反應液21μl，42℃5min，94℃5min，（94℃5s，60℃40s）×40cycles，37℃恒溫。（4）測序：PCR體系及循環條件為HBV DNA模板2μl、BigDye Mix 2μl、引物（3.2pmol）1μl，96℃1min，（96℃10s，51℃ 10s，60℃ 3min10s）×25cycles，12℃保溫。（5）基因分型：用EDTA-酒精純化PCR產物，用去離子甲酰胺溶解后上3730XL測序并進行分型。

1.3統計學方法 采用SPSS17.0統計軟件。Kolmog orov-Smirnov檢驗法作數據正態分布檢驗，數據符合正態分布，計量資料以（x±s）表示，組間統計采用單因素方差分析，計數資料采用χ2檢驗，將HBV感染后疾病轉歸的可能相關因素進行多因素Logistic回歸分析（累積Logistic模型）。P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1xMAP液態芯片技術檢測各組miRNA結果 見表1。

表1　HBV相關肝病慢性化進展不同時期PBMC中的miRNA的表達結果（x±s）

2.2HBV感染后肝病慢性化演變不同階段的HBV DNA P基因區點突變及分型結果 見表2及表3。

表2　不同基因型感染的乙肝患者的臨床特征［n（%）］

表3　HBV感染相關肝病慢性化進展不同臨床階段P區耐藥突變位點及變異方式

2.3HBV感染相關肝病慢性化進展不同臨床階段自發突變位點相關的LAM/ETV耐藥情況 見表4。

表4　HBV感染肝病慢性化進展不同時期自發突變位點相關的LAM/ETV耐藥情況［n（%）］

2.4HBV感染相關肝病慢性化進程中多因素有序Logistic回歸分析 根據單因素方差/卡方檢驗分析結果剔除變量miR-372、-21、-145、-222、-191（P＞0.05）；將AHB、CHB、LC、HCC這四個HBV感染后肝病慢性化嚴重程度逐漸加重的不同時期作為應變量Y，為多分類有序變量，其余變量作為協變量，進入Ordinal過程進行單因素Logistic回歸分析，剔除變量HBeAg狀態、性別、耐藥突變（P＞0.05），將其余變量代入Ordinal過程進行多因素Logistic回歸分析，得出有統計學意義的影響因素。模型診斷比檢驗顯示回歸模型有意義（χ2=355.70，P＜0.05），模型的擬合優度檢驗（Pearson=379.50，P=1.00），偏差檢驗（χ2=107.43，P=1.00）顯示模型擬合度良好。分析結果表明基因型C、HBV DNA高水平、miR-20a表達上調、miR-126和miR-223表達下調與乙肝的慢性化進展有關。

3　討論

miRNA是近年來發現的內源性長度為21～25個核苷酸（nt）的一種以序列特異性方式轉錄后調控基因表達的非編碼單鏈RNA，成熟miRNA可與其他蛋白一起組成RNA誘導的沉默復合體，通過與靶基因mRNA的3'非翻譯區以完全互補或不完全互補方式在轉錄或翻譯水平調節相關基因表達，參與發育、增殖、分化、凋亡等多種生物學過程［4］。本研究選用表達穩定的miR-103做內參［5］，以相對定量法對miR-222、-191、-145、-21、-223、-31、-126、-20a、-372做相對定量檢測，發現HBV感染相關肝病慢性化進展不同階段PBMC中miRNA-145、-222、-31、-21、-372表達無統計學差異，提示可能與乙肝慢性演化及致病性無關。HBV感染相關肝病慢性演變過程中miR-20a表達顯著上調，NC組表達量最低，HCC組表達最高，且隨著慢性化進展其表達量逐漸增高，提示miR-20a的上調不僅參與了乙肝慢性化過程，且可能是乙肝性肝癌一個重要致病性miRNA分子。據報道miR-126在肝臟組織的表達特異性較高［6］，本研究中HBV感染相關肝病PBMC中表達量相對于NC組是下調的，且隨著疾病慢性化的進展下調的幅度越大，在HCC組miR-126的表達最低。本研究中miR-223在AHB組表達最高，提示急性感染期miR-223增高可能是一過性的急性反應性增高，從急性感染期進展為CHB、LC及HCC的過程中，其表達逐漸下調，提示miR-126及-223的下調可能與HBV相關肝病慢性化的進展有關。針對HBV相關肝病開展miRNA表達譜的研究，可為HBV急性感染到慢性化發展機制提供一個新的研究角度。

HBV基因型與患者的傳播方式、病情進展、臨床轉歸有一定聯系，感染后臨床轉歸不僅取決于患者感染時的年齡和免疫力，也與感染病毒株的基因型關系密切。本研究結果的基因型以B和C型為主，在檢測的169例標本中未發現其他型別的病毒株。基因型在不同HBV肝病慢性化進展的不同時期的分布具有統計學差異（P＜0.05），隨著病情的進展，C基因型的概率越高，提示C基因型可能與乙肝的慢性化進展有關，更易導致患者發生更嚴重的肝病。乙肝慢性化進展過程是一個機體和病毒多因素相互作用的結果，本研究收集未經過抗病毒治療的HBV感染者完整的臨床信息，結合實驗進行多因素Logistic回歸分析篩選出HBV DNA載量、基因型和miR-20a、miR-223、miR-126是乙肝慢性化進展的影響因素，推測其可能是HBV感染后慢性化進展為肝硬化至肝癌的推動因素，為探索乙肝的慢性化進展機制、臨床預防、治療、判斷預后提供參考。

1 中華人民共和國衛生部.全國人群乙肝血清流行病學調查結果.北京：衛生部,2008.

2 Thakur V,Guptan RC,Kazim SN,et al.Profile,sepectrum and significance of HBV genotypes in chronic liver disease patients in the Indian subcontinent.J Gastroenterology and Hepatol,2002,17（2）：165～170.

3 中華醫學會肝病學分會,中華醫學會感染病學分會.慢性乙型肝炎防治指（2010年版）.中華肝臟病雜志,2011,19（1）：13～24.

4 BartelDP.MicroRNAs：genomics,biogenesis,mechanism,andfunction. Cell 2004,116（2）：281～297.

5 Peltier HJ,Latham GJ.Normalization of microRNA expression levels in quantitative RT-PCR assays：Identification of suitable reference RNA targets in normal and cancerous human solid tissues.RNA,2008, 14： 844～852.

6 Landgraf P,Rusu M,Sheridan R,et a1.A mammalian microRNA expression atlas based on small RNA library sequencing.Cell,2007, 129（7）：1401～1414.

HBV genotype xMAP liqued chip miRNA P gene mutation

236800安徽省亳州市人民醫院（敖家富 冀文娟張靜）

215006蘇州大學附屬第一醫院（顧國浩 蔣敏）

【Abstrat】 Objective To explore the related factors of HBV in the process of its chronic development，and to analyze their roles in the HBV chronic evolution and appraise their value of diagnosis，treatment and prognosis. Methods Establishing the detection Methods of miRNA（miR-191、-223、-222、-145、-21、-31、-126、-20a、-372）in peripheral blood mononuclear cell of HBV infected patients by xMAP bead-based suspension array，and use the technology to detect the expression of miRNA in different HBV infected periods.Using direct sequencing method to detect matching serum sample's HBV genotype and P gene area resistance locus mutation，and analyze gender，age，HBV genotype，HBV DNA load level，gene mutation，miRNA expression level，HBeAg state by Logistic regression analysis，dicuss which related with the disease outcomes after infected HBV and play great roles in the chronic evolution. Results HBV genotype C，the continuous high level expression of DNA loads，miR-20a expression，miR-126 and miR-223 expression were infl uence factors in progress of chronic hepatitis B（P<0.05），while the HBeAg status，natural occurrence of drug resistance related locus mutation，age，gender had no statistical signifi cance（P>0.05）with the chronic progress. Conclusion C genotype，HBV DNA continuous high loads，high expression of miR-20a and low expression of miR-126，-223 maybe the related factors of hepatitis B chronic evolution，especially maybe the liver cancer risk factors.the conventional detect genotype，HBV DNA and miRNA for monitoring，prognosis and timely treatment to prevent chronic hepatitis B developed to LC and HCC provide information.