葡萄酒有機酸研究現狀及應用展望

莫燕霞，殷居易，顧曉俊，陳梅珍，何衛敏，吳維兒

（寧波出入境檢驗檢疫局，浙江寧波315800）

葡萄酒有機酸研究現狀及應用展望

莫燕霞，殷居易，顧曉俊，陳梅珍，何衛敏，吳維兒

（寧波出入境檢驗檢疫局，浙江寧波315800）

有機酸成分研究是探索葡萄酒中呈味物質與地域環境、釀酒工藝、葡萄酒質量等關系的重要手段。本文介紹了葡萄酒中主要有機酸種類及其在發酵過程中的變化，綜述了葡萄酒中有機酸的分析檢測方法，并對葡萄酒中有機酸成分研究的發展趨勢及應用進行了展望。

葡萄酒，有機酸，分析方法，應用

葡萄酒都含有酸味物質，其對于葡萄酒的味感、穩定性的形成和陳釀特性具有重要作用。適量的酸味物質是構成葡萄酒爽利、清新等口感特征的要素。酸度過低，酒體會平淡乏味；酸度過高，酒體生硬粗澀［1］。有機酸的種類、濃度與葡萄酒的類型和品質優劣有很大關系，調節著酸堿的平衡，影響葡萄酒的口感、色澤及生物穩定性。葡萄酒中每種酸各有特點和功效，在葡萄酒中發揮著不同的作用。有機酸的定量測定在葡萄酒品質鑒定中占有重要地位，已經越來越受到人們的關注［2-4］。

本文將圍繞葡萄酒中主要有機酸的類型及其在發酵過程中的變化，分析方法的比較與評價進行綜述，并對葡萄酒有機酸成分研究的思路和應用進行展望。

1　葡萄酒中主要有機酸

葡萄酒中主要有機酸有酒石酸、蘋果酸、檸檬酸、琥珀酸、乳酸、乙酸。各有機酸分子結構見圖1。酒石酸、蘋果酸和檸檬酸源于葡萄漿果，另外三種酸是由酒精發酵和細菌活動形成。

酒石酸（Tartaric acid）又名葡萄酸，是葡萄和葡萄酒中的主要有機酸，也是葡萄的特征酸。酒石酸是抗葡萄果實呼吸氧化作用和抗酒中細菌作用的酸類，對葡萄著色與抗病有重要作用。葡萄酒中酒石酸含量大約為5～10g/L，決定著葡萄酒的pH，它的濃度主要取決于葡萄的品種特性及采收時果實大小。葡萄中存在的酒石酸的異構體是L（+）型，由葡萄糖經過發酵產生［5］。隨著時間的推移，葡萄酒中部分酒石酸會以酒石酸鹽的形式存在。

圖1　葡萄酒中主要有機酸的化學結構式Fig.1　Molecular structure ofmain organic acids ofwine

蘋果酸（Malic acid）是葡萄果實中自然形成的有機酸之一，是葡萄酒釀造過程中的一種關鍵酸，對于確定葡萄是否成熟及葡萄酒釀造是否精心都有著重要的作用，尤其是紅葡萄酒釀造過程中，適時地進行蘋果酸-乳酸發酵對于提高酒的生物穩定性、改善酒質具有相當大的作用。葡萄中存在的蘋果酸的異構體是L（+）型，由葡萄糖經丙酮酸合成［6］。蘋果酸含量隨葡萄品種以及成熟期溫度條件引起的呼吸作用不同而有很大變化，其最終濃度也受漿果大小的影響。分析葡萄果實、葡萄汁、發酵液及葡萄酒中蘋果酸含量可以幫助判斷葡萄果實的成熟情況及成品葡萄酒質量的優劣情況。

檸檬酸（Citric acid）是葡萄的一種正常組分。不論生青葡萄或者成熟葡萄，都含有檸檬酸。純粹的酒精發酵作用也經常產生少量的檸檬酸，其含量可達100～150mg/L。葡萄酒中檸檬酸的含量變化很大，相差1倍到10倍。紅葡萄酒含有的檸檬酸往往少于白葡萄酒的含量，這是因為當細菌使紅葡萄酒發生蘋果酸乳酸發酵作用的同時，會平行地消耗現存的檸檬酸，消耗量幾乎達到全部檸檬酸含量。

琥珀酸（Succinic acid）是葡萄酒所含有機酸類中最富有味覺反應的一種酸，味感復雜，既酸又苦，性狀穩定，可溶于水和酒精，能抵抗細菌性發酵的破壞作用。

乙酸（Acetic acid）是揮發酸，是葡萄酒釀造儲存過程的“晴雨表”，含量過高時不利于葡萄酒香氣質量。Erasmus等［7］發現冰酒中含有高濃度乙酸，這可能是葡萄汁中高糖度產生的高滲透壓影響酵母而使其生成的副產物。

乳酸（Lactic acid）是葡萄酒二次發酵階段的蘋果酸-乳酸發酵過程產生的，濃度范圍大約為0～2.5g/L。乳酸的酸味比蘋果酸低很多且穩定性高，所以乳酸發酵可使葡萄酒酸度降低且使酒體更加穩定，不易變質［8］。

2　葡萄酒發酵過程中主要有機酸的變化

在葡萄酒發酵過程中，一部分酒石酸會由于酒石酸氫鉀的沉淀作用而失去，一部分酒石酸被乳酸菌降解生成乳酸和乙酸，使揮發酸含量增加。蘋果酸既可被酵母代謝，又可被合成。繼酒精發酵后的蘋果酸-乳酸發酵中，蘋果酸可被轉化成酒精或乳酸，而生成的乳酸，其爽滑口味可以提升葡萄酒的感官特征。乳酸能被醋酸菌氧化分解，乙酸發酵過程中乳酸含量會減少，凡是沒有遭受細菌作用的葡萄酒，一般乳酸含量都較少。乙酸含量很少，當葡萄酒受到某些細菌污染后可產生大量乙酸。檸檬酸在酒精發酵過程中產生，隨后在蘋果酸-乳酸發酵中，會被當作底物平行地消耗，消耗量能達到全部含量，而消耗后使其主要變為揮發酸，不再有檸檬酸存在［9］，因此檸檬酸對葡萄酒風味影響較小，但有時會作為絡合劑加入到葡萄酒中，吸附一些離子如Fe3+、Cu2+以防止金屬凝膠的形成［10］。琥珀酸主要來自糖分子的發酵作用，少量來自于所含谷氨酸的變化，在谷氨酸存在時，琥珀酸積累增多［11］。

3　葡萄酒中有機酸的分析檢測方法

葡萄酒中有機酸的主要檢測方法有高效液相色譜法、氣相色譜法、離子色譜法、酸堿滴定法、紙色譜法、薄層色譜法等。筆者參閱國內外研究者的研究報告和文獻，綜述前人關于各種方法檢測葡萄酒中有機酸的成果。

3.1高效液相色譜法（HPLC）

高效液相色譜法是目前應用最多的色譜分析方法，HPLC系統由流動相儲液瓶、輸液泵、進樣器、色譜柱、檢測器和記錄器組成。與經典液相色譜相比有以下優點：速度快、分辨率高、靈敏度高、色譜柱可反復使用、樣品量少且易回收等。它的分離模式與檢測方法多種多樣，可以根據樣品的構成與性質來選擇合適的色譜條件。

利用HPLC對葡萄酒中芳香族有機酸和多元酸進行直接測定，可以避免色素和雜質的影響，測定方法簡便，快速準確。李小剛等［12］應用高效液相色譜法同時測定葡萄酒的有機酸及乙酸，各組分分離良好，結果滿意。馬麗艷等［13］采用日本資生堂CAPCELL PAK MG S5色譜柱（150mm×4.6mm，5μm），乙腈-磷酸溶液為流動相等梯度洗脫，流速為0.5m L/m in，在210nm和243nm下檢測，外標法定量，結果顯示八種有機酸線性關系良好，平均回收率在85%～120%之間，精密度、穩定性的RSD均小于5%。Dopico［14］采用固相萃取法進行前處理，用高效液相色譜法和UV與光敏二極管檢測器測定Vinho Verde葡萄酒中的有機酸和酚酸。陳文華等［15］利用高效液相色譜法（反相ODS色譜柱，磷酸溶液作流動相）測定通化野生原汁葡萄酒、王朝干白葡、野生山葡萄酒、張裕干紅葡萄酒、野生原汁山葡萄酒中的酒石酸和檸檬酸含量。高年發等［16］對長城和王朝葡萄釀酒公司的15種原酒高速離心預處理后用HPLC測定其中有機酸含量。結果表明：葡萄酒中主要有機酸成分是酒石酸、L-蘋果酸和L-乳酸，檸檬酸、琥珀酸和乙酸的含量很少；長城原酒中的總酸（以酒石酸為主）含量比王朝原酒中的高。譚志靜［17］采用Hibarcolumn RT色譜柱，以磷酸鹽緩沖溶液（pH=2.5）為流動相，在檢測波長為214nm的條件下測定葡萄果肉和葡萄皮中有機酸（檸檬酸、蘋果酸等）含量。李君霞等［18］同樣采用高效液相色譜法分離葡萄酒中5種有機酸（酒石酸、蘋果酸、檸檬酸、乳酸、琥珀酸），色譜條件為：ODSC18反相柱（200mm× 4.6mm，5μm）；柱溫30℃；以0.05mol/L磷酸二氫氨水溶液（pH 2.60～2.65）為流動相；進樣量為20μL；流速1.0m L/m in；檢測波長214nm；運行時間7m in。保留時間定性，ESTD法定量。5種有機酸在檢測范圍內呈良好線性關系，回收率在96%～102%之間，精密度實驗的RSD小于10%。該方法操作簡單，重復性好，準確度高，測定時間短。

高效液相色譜法靈敏度高，但是存在樣品預處理操作繁瑣、測定周期長、實驗成本高、測定完后需要清除殘留樣品等缺點，若與其他技術聯用，則能縮短檢測周期、降低實驗成本。

Vonach等［19］率先將高效液相色譜法（HPLC）與傅立葉轉換紅外光譜法（FTIR）聯用，為葡萄酒中有機酸的檢測提供了一種新的可行的直接測定方法。Edelmann等［20］將金剛石衰減全反射（ATR）元件裝入具有低死體積的流通池，在線中紅外檢測與高效液相色譜法聯用，分析紅葡萄酒中有機酸、糖和醇類。用多元曲線分辨-交替最小二乘法（MCR-ALS）進行定量分析。Akira Kotani等［21］將電化學還原醌的伏安法測定酸的方法應用于高效液相色譜法（HPLC），結合電化學檢測（ED）檢測酒中的有機酸（乙酸、檸檬酸、乳酸、蘋果酸、琥珀酸和酒石酸）。使用離子排斥柱和電化學檢測器與玻璃碳工作電極，含有2-甲基-1，4-萘醌水溶液的0.1mmol/L高氯酸和乙醇作為流動相和試劑溶液，分析物無需衍生，重復性好、過程簡單快速。

3.2氣相色譜法（GC）和氣相色譜-質譜聯用（GC-MS）

氣相色譜使用成本較低，對環境友好，現已得到廣泛應用，毛細管柱-氣相色譜分析葡萄酒中的多元有機酸成分是葡萄酒成分鑒定、質量控制以及了解葡萄酒酸類特點的重要手段。葡萄酒有機酸種類繁多，有些組分含量極低，通過普通手段很難檢測，而且有些組分在分離提取時容易受到條件的影響發生結構上的改變或者與其他外來物質結合。前處理新方法的開發和質譜聯用技術的發展為葡萄酒多元有機酸成分分析工作提供了便利。對于含量較低和基質較復雜的葡萄酒樣品，研究者新開發了以下幾種柱前處理方法：固相微萃取、樹脂富集界面衍生、酯化篩選衍生。

張岱等［22］采用頂空固相微萃取-氣相色譜質譜聯用技術，對比分析了赤霞珠干化葡萄和干化葡萄酒的香氣成分，檢測出34種干化赤霞珠葡萄香氣成分和45種干化葡萄酒香氣成分，主要為醇類、有機酸、醛類等物質。杜曦等［23］應用衍生化氣相色譜法分離測定葡萄、葡萄酒中多元有機酸，通過不同酯化方法比較，選擇在N，N-二甲基甲酰胺非質子溶劑中，利用碘乙烷與多元有機酸的四甲基銨鹽反應制備相應的乙酯，在SE-30色譜柱上利用程序升溫進行分離，采用內標法鑒定分析及比較測定葡萄和葡萄酒中的多種多元有機酸性質和含量。王方等［24］以王朝赤霞珠、梅鹿輒兩種干紅葡萄酒為研究對象，利用液液萃取法提取香氣成分，結合氣相色譜-質譜聯用技術檢測葡萄酒中77種香氣組分（包含乙酸、蘋果酸、琥珀酸等有機酸）。李素岳等［25］采用固相微萃取（SPME）結合氣相色譜-質譜聯用技術（GC-MS）對玫瑰加香葡萄酒進行分析，鑒定出62種香氣成分（含乙酸等有機酸類8種）。

3.3離子色譜法（IC）

離子色譜法操作簡單，靈敏度高，可廣泛用于多種樣品的分析。按分離原理分為離子交換色譜（IEC）和離子排斥色譜（ICE）兩種：IEC是樹脂上可電離離子與流動相中具有相同電荷離子及被測組分離子進行可逆交換，根據各離子交換基團具有不同電荷吸引力而分離，分離低分子有機酸時無須對樣品進行復雜的預處理；ICE也是分析低分子質量有機酸的有效方法，具有以下優點：極適合于含水基體；對強親水性物質不會造成損失；無需柱前衍生處理；幾乎不受無機陰離子干擾。

Kupina［26］早在1991年就用離子色譜法（Dionex Onm iPac PAX-500柱）分離和定量分析了葡萄汁和葡萄酒樣品中的主要有機酸（酒石酸、蘋果酸和檸檬酸）。田鵬等［27］選用常見的鹽酸溶液作淋洗液，以四丁基氫氧化銨為再生液，考察了淋洗液濃度、流量等因素對分離和測定的影響，對啤酒和白葡萄酒中常見有機酸在陰離子排斥色譜柱上的保留行為進行了系統研究。胡維勝等［28］選用色譜柱為Met rosep Organic Acids有機酸柱，Met rosep RP Guard保護柱，淋洗液選用0.3mmol/L硫酸和15%丙酮的混合溶液，再生液為10mmol/L LiCl，測定了麥汁和啤酒體系中檸檬酸等9種有機酸的含量。李振林［29］用DX-500型離子色譜儀，IonPac-AG4A2SC保護柱，IonPac-AS4A2SC分析柱，AD20型吸光度檢測器與ED40型電化學檢測器（電導檢測方式）串聯使用，分別在190、206nm檢測波長處測定了葡萄酒中糖精鈉、甜蜜素和檸檬酸的含量。原小寓等［30］采用Shim-pack SCR-102H型離子排斥色譜柱，選用2.0mmol/L p-甲苯磺酸-乙腈（體積比91∶9）為淋洗液，分離測定7種有機酸（檸檬酸、酒石酸、蘋果酸等）。徐繼明［31］以TSKgel Oapak2A色譜柱，以2mmol的苯甲酸為流動相，結合電導檢測同時測定了葡萄酒中的多種有機酸（檸檬酸、蘋果酸等）。林華影等［32］將樣品經提取、脫色、過濾后用IonPac AS11分離柱分離，以EG 40自動淋洗液發生器生成的5～34mmol/LKOH為淋洗液洗脫，抑制電導檢測器檢測樣品（含葡萄酒）中乳酸、琥珀酸、蘋果酸、酒石酸等21種有機酸。張斯等［33］通過離子色譜法IonPac AS11（4mm×250mm）分析柱，0.2～25mmol/L KOH為淋洗液對赤霞珠、梅洛和西拉葡萄酒進行9種有機酸含量的測定（分別是乳酸、乙酸、丙烯酸、山梨酸、苯甲酸、蘋果酸、酒石酸、富馬酸和檸檬酸），共挑選100個來自法國、意大利、澳大利亞、智利和美國的葡萄酒樣品進行測定。

離子色譜由于淋洗液和柱填料的特殊性，對樣品中蛋白質含量有嚴格限定，不適合做復雜的樣品分析，而且柱子的容量小，進樣量少。因此，IC在測定葡萄酒中有機酸的過程中，需嚴格遵循以上檢測要求。

3.4毛細管電泳法（CE）

毛細管電泳是以高壓電場為驅動力、以毛細管為分離通道、依據樣品中各組分之間淌度和分配差異而實現分離的一類液相分離技術，具有色譜和電泳兩種分離機制［34］，具有高效、快速、進樣體積小、溶劑消耗少和污染小等特點［35］。基于毛細管便宜且更換簡單等突出優點，毛細管電泳已經越來越廣泛地被用于有機酸的分析測定［36］。

A.Casti?eira等［37］通過優化五種背景電解質，使用3mmol/L磷酸鹽和0.5mmol/L十四烷基溴化銨（MTAB）于pH 6.5電滲流改性劑的電解液，直接進樣后檢測葡萄酒中酒石酸、蘋果酸、琥珀酸、乙酸和乳酸。該定量方法的加標回收率在90%～102%范圍內，精密度小于1%。在2002年，A Casti?eira等［38］又使用磷酸鹽基載體電解質和在pH 6.5下檢測葡萄酒樣中五種有機酸，該毛細管電泳方法在其他常用方法優點的基礎上，使用有機酸的定量鄰苯二甲酸緩沖液，UV檢測，對酒石酸、蘋果酸、乙酸、琥珀酸和乳酸的分離和測定大約在6m in內就可實現。R G Peres等［39］開發和驗證了毛細管電泳法在葡萄酒中有機酸檢測方面的有效應用，含0.2mmol/L十六烷基三甲基和pH為3.6、0.2mmol/L的3，5-二硝基苯甲酸溴（DNB）電解質作為反向流動液，254nm間接紫外吸光度檢測。該方法表現出良好的性能特征：線性優異，檢測和定量限低，分離時間短，變化注射系數均小于5%，回收率在95%～102%之間。李永庫等［40］應用毛細管電泳-電噴霧電離質譜（CE-ESI-MS）聯用法同時測定葡萄酒中草酸、富馬酸、琥珀酸、檸檬酸、蘋果酸、抗壞血酸、酒石酸和乳酸8種主要有效成分含量。在未涂層石英毛細管（50μm×80cm）中，以40.0mmol/L醋酸銨（用1.0mol/L醋酸調至pH 4.5）為緩沖溶液，30%異丙醇（含3.0mmol/L氨水）為鞘液，分離電壓25.0kV，各組分在15m in內得到完全分離。

毛細管電泳雖然已經得到廣泛應用，但與其他分析方法相比，其靈敏度和重現性方面仍存在不足。隨著各種高靈敏度檢測器以及自動進樣器的使用，不但可使測定精度和檢測靈敏度大大提高，而且能完成連續自動進樣及在線分析，使毛細管電泳技術能更加適合于實際應用。

3.5酶法（ED）

酶化學法是基于測定NADH酶或NADPH酶活性的增加或減少來檢測有機酸，這些酶有自身的吸光區域，一般用分光光度計測其340nm處的吸光值。酶法主要優點在于特異性、專一性，使某些有機酸的L或D-異構體很容易被檢測，缺點是每次實驗中只有一個有機酸被測定，相對其他方法比較耗時。Jose等［41］運用流動注射系統，將NADH酶注入樣品中，通過酶的變化同時檢測葡萄酒中的L（+）乳酸和L（-）蘋果酸。R Puchades等［42］使用酶固定化開管式反應器流動注射分析方法同時測定葡萄酒中的兩種有機酸（蘋果酸和乳酸），將蘋果酸脫氫酶和L-乳酸脫氫酶注入流動注射系統（FIA），通過熒光法測定產物NADH酶的量來分析蘋果酸和乳酸。

3.6其他方法

葡萄酒中有機酸的測定方法還有酸堿滴定法［43］、比色分析法［44］、薄層色譜法［45］等。這些方法雖然操作簡便，但是靈敏度低，雜質干擾嚴重，能達到同時分離的有機酸種類較少，因此往往只適用于某些特殊樣品或不常見有機酸的分析。

4　葡萄酒有機酸應用展望

了解葡萄酒中有機酸的形成機理以及種類、含量、比例與葡萄酒品質的量化關系，可以為制定葡萄酒質量的評價標準提供參考，也可為指導釀酒生產提供理論依據。葡萄酒有機酸檢測作為葡萄酒的重要研究領域，對其進行更廣泛的拓展研究具有重要的理論和實際意義。

目前已有研究者將統計學方法、TPCA（主成分分析）等［46］初步應用于葡萄酒質量分析與評價，為葡萄酒有機酸評價體系的建立提供了理論參考，但要為葡萄酒質量控制和品質區分提供更加完善有效的途徑，還需進行更深入的實踐與應用。

葡萄酒真偽鑒定是當今國內外檢驗的一個熱點。葡萄酒摻假事件已有相關報道，生產者為降低成本，用“三精一水”（酒精、糖精、香精、水）勾兌，再添加一些合成有機酸等成分制成葡萄酒或者將價廉的酒摻假到價錢比較昂貴的酒中以獲得高額利潤。不同種類葡萄酒的有機酸種類和含量差別較大，在一定條件下，可以嘗試通過測定各種有機酸含量來鑒別葡萄酒摻假與否。

有機酸含量除受種植地域、成分和采摘年份的影響外，也受釀造工藝及環境條件等影響。通過研究葡萄酒發酵過程中有機酸的動態變化規律，可以為改進生產工藝和調控葡萄酒品質提供重要依據。但有機酸的發酵變化是一個極為復雜的過程，其含量高低是酵母類型、發酵工藝條件等因素共同作用的結果，還有許多方面尚不清楚，尚待研究者們進一步的研究。

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Research status and application prospects of organic acids in w ine

MO Yan-xia，YIN Ju-yi，GU Xiao-jun，CHEN M ei-zhen，HEW ei-m in，WUW ei-er
（Ningbo Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau，Ningbo 315800，China）

Organic constituents was an importantmeans ofexp loring the wine flavor substances and geographical environment，w inemaking，w ine quality relationships.This overview concerned the c lassifying of the organic acids and the changes during fermentation，reviewed the analysis and detection methods of organic acids in w ine.The p rospects of the app lication aboutorganic acids in w ines had been dep icted.

w ine；organic acids；analyticalmethod；app lication

TS261

A

1002-0306（2015）06-0380-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.06.074

2014-06-17

莫燕霞（1981-），女，碩士研究生，工程師，研究方向：食品檢測分析。

寧波市級科技計劃項目（2012F1002）。