米糠多糖理化性質研究

陳新，孫維礦，趙玲，劉梁

（武漢輕工大學生物與制藥工程學院，湖北武漢430023）

米糠多糖理化性質研究

陳新，孫維礦，趙玲，劉梁*

（武漢輕工大學生物與制藥工程學院，湖北武漢430023）

通過Molish、Benidick、I-KI等顏色反應研究米糠多糖的理化性質，并運用NMR、HPLC、IR等現代分析手段對米糠多糖的單糖組成、分子量分布、理化性質進行了研究。結果表明米糠多糖中葡萄糖、木糖、半乳糖、阿拉伯糖的摩爾比為1.669∶1∶0.225∶1.228，分子量在4.878×105（±0.506%）范圍的多糖含量為70.8%，分子量在9.802×104（±3.368%）范圍的多糖含量為29.2%。

米糠多糖；理化性質；糖組成；分子量分布

稻米加工中，糙米皮層被碾除得到精白米，同時得到副產物米糠（即被碾下的籽粒的表皮、部分糊粉層、米胚芽和少量破碎胚乳的混合物）［1-2］。米糠重量雖然不足糙米的10%，但糙米中約2/3的營養素存在米糠中，因此，米糠是一種具有很大潛力的優質食品原料［3-4］。米糠多糖存在于稻谷穎果皮層里，是目前尚未被深入開發和廣泛應用的主要營養成分之一［5-6］。采用不同的提取工藝可以得到多種米糠多糖，它們都具有顯著的生物活性和保健功能，不僅具有一般多糖或膳食纖維所具有的生理功能，而且還具有抗腫瘤、降血糖、降膽固醇和增強免疫等多種生物活性［7-9］。本實驗室從米糠中提取、純化得到米糠多糖，并對其理化性質、單糖組成、分子量分布等參數進行了系統分析和測試，實驗結果對米糠的深加工和米糠多糖類產品的研究和開發具有重要的指導意義。

1材料與方法

1.1 試驗材料與試劑

米糠多糖（本實驗室從米糠中分離純化所得）；乙醇、丙酮，乙醚、正丁醇、異丙醇、α-萘酚、苯酚、硫酸、檸檬酸鈉、無水碳酸鈉、結晶硫酸銅、碘、碘化鉀、茚三酮、咔唑、三氟乙酸、溴化鉀（均為AR）；葡萄糖、鼠李糖、甘露糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、半乳糖醛酸（均為BR）。

1.2 儀器和設備

安捷倫1026型高效液相色譜儀；NEXUS-670型傅里葉紅外光譜儀（美國NICOLET公司生產）；Bruker AV400型雙通道全數字化傅里葉超導核磁共振譜儀。

1.3 試驗方法

1.3.1 多糖的理化性質

稱取25 mg米糠多糖，溶解于超純水中，定溶于25 mL容量瓶中，得1.0 mg/mL的米糠多糖溶液，待用。

1）溶解性試驗：將多糖溶于冷水、熱水、乙酸乙酯、乙醇、丙酮，乙醚、正丁醇、異丙醇中，觀察其溶解情況。

2）α-萘酚試驗（Molish反應）：往試管中加入1 mL 1.0 mg/mL的米糠多糖水溶液，滴入2滴10%的α-萘酚乙醇溶液，混合均勻后將試管傾斜，沿管壁慢慢加入1 mL濃硫酸（勿搖動）。豎直后仔細觀察兩層液面交界處顏色變化，若在兩層交界處出現紫紅色的環，表明樣品中含有糖類化合物。

3）苯酚-硫酸試驗：往試管中加入1.0 mL 1.0 mg/mL的米糠多糖樣品水溶液，加入1.0 mL 6%的苯酚溶液，搖勻，并迅速滴加5 mL濃硫酸，靜置10 min，振蕩搖勻，觀察溶液顏色變化。

4）Benedict試驗：Benedict試劑的配制，將85 g檸檬酸鈉和50 g無水碳酸鈉溶于400 mL水中，另將8.5 g結晶硫酸銅溶于50 mL水中，將硫酸銅溶液注入檸檬酸鈉溶液中，如溶液不澄清，可過濾去除不溶物。

鑒定操作：往試管中加入1 mL Benedict試劑和0.5 mL 1.0 mg/mL的米糠多糖水溶液，在沸水浴中加熱3 min～5 min，冷卻至室溫，若有紅色或黃色沉淀生成，表明樣品中含有還原性糖。

5）碘反應：將提取多糖樣品配成1 mg/mL的溶液，用淀粉配成1.0 mg/mL作陽性對照，看是否會變藍色。

6）I-KI反應：用吸管吸取5滴1.0 mg/mL的米糠多糖樣品水溶液于點滴板小孔內，加2滴I-KI溶液（IKI溶液配制方法：碘化鉀3 g；蒸餾水100 mL；碘1 g。先將碘化鉀溶于超純水中，待全部溶解后再加碘，振蕩溶解）以蒸餾水和淀粉溶液作對照。觀察顏色變化。

7）茚三酮反應：分別取1 mL濃度為1 mg/mL的多糖樣品溶液，加入0.5 mL的0.1%茚三酮乙醇溶液，震蕩搖勻，煮沸5 min，冷卻，觀察顏色變化。以蒸餾水作陰性對照，0.5%氨基酸作為陽性對照。

8）硫酸-咔唑反應：取1 mL濃度為1 mg/mL的多糖樣品加入濃硫酸5.0 mL，邊加邊流水冷卻，冷至室溫后加入0.15%的咔唑無水乙醇溶液0.20 mL，搖勻，再置沸水浴中加熱15 min，觀察顏色變化，若有紫色生成，說明多糖樣品中含有糖醛酸。

1.3.2 米糠多糖單糖組成的HPLC分析

1.3.2.1 供試品溶液的配制

稱取米糠多糖12.5 mg，溶于5 mL 4 mol/L三氟乙酸溶液中，N2封管，100℃水解4 h，減壓旋轉濃縮蒸干。用水溶解并定溶于10 mL容量瓶中，0.45 μm濾膜過濾，取濾液20 μL進樣。

1.3.2.2 對照品溶液的制備

稱取葡萄糖、鼠李糖、甘露糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、半乳糖醛酸7種單糖各10 mg，分別用水溶解并定容于10 mL容量瓶中，即得濃度分別為1.0 mg/mL的各單糖標準溶液。0.45 μm濾膜過濾，取濾液20 μL進樣。

分別稱取葡萄糖、阿拉伯糖、木糖及半乳糖12.5 mg，混合后用水溶解并定容于50 mL容量瓶中，作為對照品母液。分別從對照品母液中準確移取0.75、1.5、3.0、6.0、7.5、18.75 mL至25mL容量瓶中，配制出濃度分別為30.0、60.0、120.0、240、300、750 μg/mL的對照品溶液。0.45 μm濾膜過濾，取濾液20 μL進樣。

1.3.2.3 色譜條件

高效液相色譜儀（備有Varian Prostar 210高壓泵，7725Ⅰ型手動進樣器，Varian Prostar 500柱溫箱，SEDEX 90 LT-ELSD低溫型蒸發光散射檢測器），色譜柱型號為sugar sp0810 300 mm×8 mm，7 μm，流動相為超純水（用前經0.45 μm濾膜過濾），柱溫箱溫度為25℃，流速為1.0 mL/min。米糠多糖及對照品檢測時間均為20 min。

1.3.3 米糠多糖分子量的測定

激光光散射法測定多糖分子量原理：激光照射到多糖樣品時，會在各個方向產生散射光。SEDEX 90 LT-ELSD低溫型蒸發光散射檢測器可在18個角度對散射光進行檢測，收集散射光的強度。散射光強度與分子量和溶液濃度成正比。散射光角度的變化與分子的尺寸大小有關。高分子溶液的激光散射可基本表示。

式中：K為與溶劑性質和入射光頻率相關的常數；c為溶液濃度；R（θ）為不同角度去除溶劑影響后的散射光強度；θ為散射光角度；MW為平均分子量；P（θ）為散射光強度隨角度變化的函數；A2為第二維里系數，是溶劑與溶質相互作用的度量，一般溶液極稀時可忽略；n0為溶劑的折射率；dn/dc為折光指數增量，即溶液折射率與濃度變化的比值；N為阿伏加德羅常數；λ為入射光波長；Rg為高分子均方末端距，即鏈質量中心至各個鏈段距離平方的平均值。

R（θ）為儀器測定量，K、c、n0、dn/dc、N、λ、θ均為常數或已知量，只有MW、Rg2和A23個高分子鏈的基本參數為未知值，通過多個角度光散射強度的測定，即可推導求出。

應對保健食品、嬰幼兒配方食品、特殊醫學用途配方食品等特殊食品進行專柜或專區銷售，并設立明顯的設立提示牌，注明“****銷售專區（或專柜）”字樣。

1.3.4 核磁共振測定

多糖樣品用D2O配成濃度為25 mg/mL的樣品溶液，室溫下利用Bruker AV400超導核磁共振譜儀進行測試分析。

2結果與討論

2.1 米糠多糖的理化性質

米糠多糖冷凍干燥后為白色絮狀固體，極易溶于熱水，不溶于乙酸乙酯、乙醇、丙酮、乙醚、正丁醇等有機溶劑，水溶液為無色澄清液體。α-萘酚反應呈陽性；硫酸-苯酚反應亦呈陽性；Benedict試驗、碘反應、碘-碘化鉀反應、硫酸-咔唑反應、茚三酮反應均呈陰性。表明樣品含有多糖，不含還原糖、糖醛酸、淀粉及氨基酸、多肽、蛋白質。

2.2 米糠多糖的單糖組成

米糠多糖的液相色譜圖如圖2所示，對照品液相色譜圖如圖1所示。

圖1 對照品的液相色譜圖（溶液濃度為0.75 mg/mL）Fig.1The HPLC spectrum of the control（The concentration of the solution was 0.75 mg/mL）

圖2 米糠多糖的液相色譜圖（溶液濃度為1.25 mg/mL）Fig.2The HPLC spectrum of rice bran polysaccharide（The concentration of the solution was 1.25 mg/mL）

通過比較可知，米糠多糖樣品液相色譜圖中的葡萄糖、木糖、半乳糖和阿拉伯糖的出峰時間與對照品色譜圖一致，以對照品中各單糖濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制單糖的標準曲線，計算出米糠多糖中葡萄糖、木糖、半乳糖、阿拉伯糖的摩爾比為1.669∶1∶0.225∶1.228。

2.3 米糠多糖分子量測定

樣品溶液平行進樣3次，正確記錄樣品保留時間及色譜圖，按已知折光儀校正常數和質量回收率設為100%數據處理法計算樣品分子量及其分子量分布，實驗結果如圖3和表1所示。

圖3 米糠多糖分子量測定液相色譜圖Fig.3The HPLC spectrum of rice bran polysaccharide for molecular weight detected

表1 米糠多糖的分子量分布Table 1The molecular weight distribution of rice bran polysaccharide

2.4 米糠多糖紅外光譜分析

紅外光譜法是研究有機化合物分子結構的一種重要方法，也是研究糖類化合物結構不可或缺的手段，通過分析各種糖的特征吸收，可以檢測糖環的構象和糖苷鍵的構型。由于糖分子中的官能團主要為羥基和碳氫鍵，因此，整個光譜的吸收峰較少，而且大多寬而鈍，這是由于形成氫鍵所致。

米糠多糖的紅外光譜圖如圖4所示。

圖4米糠多糖的紅外吸收光譜Fig.4IR spectrum of rice bran polysaccharide

圖4 可看到，3 385 cm-1出現的寬峰是糖分子內或分子間氫鍵O-H伸縮振動的表現；2 973 cm-1和1 411 cm-1處的吸收峰為C-H伸縮振動和變角振動引起的；以上吸收峰構成了多糖的特征吸收峰。1642 cm-1處為-CHO的C=O伸縮振動峰，1 077 cm-1是C-O振動引起的，這也與前面測定結果相一致，860 cm-1出現的吸收峰表明樣品中有α-糖苷鍵存在。

2.5 米糠多糖核磁共振分析

核磁共振（NMR）對于多糖的結構鑒定起到非常重要的作用。如糖類的化學組成，糖苷鍵的構型，糖環的構象，糖殘基的排列順序，糖苷鍵的鍵合位置等。NMR檢測組成有機化合物分子的原子核性質及其與周圍化學環境的相互作用，一維核磁共振氫譜（1HNMR）為多糖的結構分析提供很多有用的信息。米糠多糖的1H-NMR如圖5所示。

從圖5中可以看出δH5.209左右為異頭氫，由譜圖可以看出異頭氫的峰主要有一種；δH4.613為溶劑峰；δH4.091～3.273之間有較多的氫峰，主要是與O相連的氫峰；δH2.035～1.720間的峰主要為-CH2的氫峰。由此可判斷樣品不含蛋白質。

圖5 米糠多糖核磁共振譜圖Fig.5HNMR spectrum of rice bran polysaccharide

3結論

運用各種物理、化學分析鑒別手段對米糠多糖的理化性質進行研究。米糠多糖易溶于水，不溶于有機溶劑，同時不含還原糖、糖醛酸、淀粉及氨基酸、多肽、蛋白質等物質。米糠多糖主要由葡萄糖、阿拉伯糖、木糖及半乳糖四種單糖組成，且葡萄糖、木糖、半乳糖、阿拉伯糖的摩爾比為1.669∶1∶0.225∶1.228。米糠多糖分子量在4.878×105（±0.506%）范圍的多糖含量為70.8%，分子量在9.802×104（±3.368%）范圍的多糖含量為29.2%。

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The Study on the Physicochemical Property of Rice Bran Polysaccharide

CHEN Xin，SUN Wei-kuang，ZHAO Ling，LIU Liang*
（School of Biological and Pharmaceutical Engineering，Wuhan Polytechnic University，Wuhan 430023，Hubei，China）

The physicochemical property of rice bran polysaccharide was studied by Molish、Benidick、I-KI color test，and he composition，molecular weight distribution were identified by NMR、HPLC、IR analysis methods.The results showed that the sugar molar composition ratio of glucose，xylose，galactose，arabia in rice bran polysaccharide was 1.669∶1∶0.225∶1.228，and the polysaccharide molecular weight distribution of was 70.8%in 4.878×105（±0.506%），29.2%in 9.802×104（±3.368%）.

rice bran polysaccharide；physicochemical property；composition；molecular weigh distribution

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.09.005

2015-01-27

國家糧食公益性行業科研專項（201313002）

陳新（1978—），男（漢），副教授，博士，研究方向：食品活性物質研究與開發。

*通信作者：劉梁（1981—），男（漢），講師，博士，研究方向：食品功能因子研究。