超聲誘導(dǎo)提取大豆中脂肪氧合酶的工藝研究

丁文武，孟麗，叢林娜，夏云空

（1.西華大學(xué)生物工程學(xué)院，四川成都610039；2.山東勝通集團(tuán)股份有限公司，山東東營(yíng)257500；3.中國(guó)科學(xué)院上海高等研究院，低碳轉(zhuǎn)化科學(xué)與工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海201210；4.四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，四川成都610065）

超聲誘導(dǎo)提取大豆中脂肪氧合酶的工藝研究

丁文武1，孟麗2，叢林娜3，夏云空4

（1.西華大學(xué)生物工程學(xué)院，四川成都610039；2.山東勝通集團(tuán)股份有限公司，山東東營(yíng)257500；3.中國(guó)科學(xué)院上海高等研究院，低碳轉(zhuǎn)化科學(xué)與工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海201210；4.四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，四川成都610065）

應(yīng)用超聲誘導(dǎo)法對(duì)大豆中脂肪氧合酶進(jìn)行了粗提，并考察了超聲溫度、時(shí)間和固液比對(duì)提取大豆中脂肪氧合酶的影響，并通過(guò)正交試驗(yàn)進(jìn)一步優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件；結(jié)果表明，大豆中脂肪氧合酶提取單因素影響最佳工藝條件為超聲溫度35℃、時(shí)間25 min、固液比1∶25 g∶mL；正交實(shí)驗(yàn)最佳工藝條件為超聲溫度30℃，時(shí)間30 min，固液比1∶30 g∶mL，此條件下所得酶活為4 033 U/mL，因此這種方法更簡(jiǎn)單迅速，提取率也更高。

大豆；脂肪氧合酶；超聲波；提取

脂肪氧合酶屬氧化還原酶，通稱脂氧酶（LOX）［1］。LOX廣泛分布于各種植物中，在豆類中具有較高的活力，其中尤以大豆中活力最高［2］，許多研究結(jié)果表明LOX在植物生理，如植物萌發(fā)、生長(zhǎng)、發(fā)育、衰老和抗性等物質(zhì)轉(zhuǎn)化中起某種重要調(diào)節(jié)作用，可以運(yùn)用于植物抗病、抗蟲和傷害反應(yīng)［3］；脂肪氧合酶也可用于漂白含有類胡蘿卜素的植物或海洋食品物質(zhì)。這樣它可用于漂白制作面包、面條或意大利面食的面粉或者漂白含有蝦青素的魚肉或魚油，因此對(duì)LOX的研究和應(yīng)用工作也正逐漸深入進(jìn)行［4-7］。

酶的提取方法有很多，包括高速組織搗碎［8］、玻璃勻漿器勻漿［9］、反復(fù)凍融法［10］、化學(xué)處理法、超聲波處理法［11］等。其中超聲提取法是研究最為廣泛的一種。超聲提取是利用超聲波具有的機(jī)械效應(yīng)，空化效應(yīng)和熱效應(yīng)，通過(guò)增大介質(zhì)分子的運(yùn)動(dòng)速度、介質(zhì)的穿透力以提取生物有效成分［12］，在天然產(chǎn)物有效成分的提取過(guò)程中日益得到科研工作者們的充分重視［13-14］。

本試驗(yàn)以大豆為原料，通過(guò)超聲誘導(dǎo)法提取大豆中脂肪氧合酶，尋找其提取的最佳工藝條件，一方面對(duì)脂肪氧合酶的酶學(xué)性質(zhì)研究提供幫助，同時(shí)也為大豆制品的研究和利用提供一定參考。

1材料和方法

1.1 試劑與儀器

1.1.1 材料

大豆：大潤(rùn)發(fā)濟(jì)南歷下店；石油醚：分析純，天津市富宇精細(xì)化工有限公司；無(wú)水乙醇：分析純，天津市富宇精細(xì)化工有限公司；亞油酸：分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；吐溫20：化學(xué)純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。

1.1.2 主要儀器

酸度計(jì)：上海般特儀器制造有限公司；超聲波清洗機(jī)：寧波新芝生物科技有限公司；電熱恒溫水浴鍋：上海森信儀器有限公司；雙光束紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；TG-16高速離心機(jī)：鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司。

1.2 方法

1.2.1 脫脂豆粉樣品的制備

大豆經(jīng)攪拌器打碎，用40目標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)篩去皮，稱取一定質(zhì)量的大豆粉，用石油醚浸泡5次，其中固液比為1∶5（g∶mL），每次浸泡3 h，得到脫脂豆粉，然后于室溫下晾干并在4℃條件下保存?zhèn)溆茫?5］。

1.2.2 影響因素的測(cè)定

固液比影響：將不同固液比樣品于20℃下超聲15 min，離心后將所得上清液配成相同體積后測(cè)酶活；超聲時(shí)間影響：將一定固液比的樣品于20℃下超聲不同時(shí)間后，離心取上清液測(cè)酶活；超聲溫度影響：將一定固液比的樣品在不同溫度下超聲一定時(shí)間后，離心取上清液測(cè)酶活。

1.2.3 酶活測(cè)定

底物溶液的配制：將0.25 mL的TWeen20溶液分散于10 mL pH 9.0的硼酸鹽緩沖溶液中，搖動(dòng)下逐滴加入0.27 mL亞油酸，然后向體系中加入一定濃度的NaOH溶液使其澄清，再用HCl溶液將體系pH調(diào)至9.0，最后把上述溶液用pH 9.0緩沖液定容到500 mL，保存?zhèn)溆茫?5-16］。

酶活測(cè)定：將0.2 mL粗酶液加入到1.5 mL底物溶液中，混勻后于25℃恒溫水浴鍋中恒溫反應(yīng)3 min，再向體系中先后各加入5 mL無(wú)水乙醇和水，混勻后用分光光度計(jì)在234 nm處測(cè)定反應(yīng)液的吸光度［15］；空白試驗(yàn)為加入粗酶液和無(wú)水乙醇后，再加入底物溶液，其余操作與反應(yīng)樣品操作相同；酶活的計(jì)算是以1 min內(nèi)反應(yīng)體系的吸光度增加0.001作為一個(gè)酶活力單位［15］。

2結(jié)果與討論

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 固液比對(duì)提取酶活的影響

固液比對(duì)提取酶活的影響如圖1所示。

圖1 固液比對(duì)提取酶活的影響Fig.1Effect of solid-to-liquid ratio of ultrasonic treatment on enzyme activity

由圖1可知隨著液固比的增大，酶活先增大后減小，這是由于隨著液固比的增大，酶加入量相對(duì)減少，溶液較稀薄，則原料顆粒被破碎的機(jī)會(huì)越大，提升了超聲波的效果，有利于酶的溶出；但是當(dāng)液固比超過(guò)一定比例后，細(xì)胞內(nèi)外的滲透壓減小，酶的溶出速度減慢，酶的提取活性降低［14］。因此確定最佳固液比為1∶25。

2.1.2超聲時(shí)間對(duì)提取酶活的影響

超聲時(shí)間對(duì)提取酶活的影響如圖2所示。

圖2 超聲時(shí)間對(duì)提取酶活的影響Fig.2Effect of time of ultrasonic treatment on enzyme activity

由圖2可知，酶活隨著超聲時(shí)間的增加呈現(xiàn)出先增加后減少的趨勢(shì)，其最佳超聲時(shí)間出現(xiàn)在25 min左右。這可能是由于超聲開(kāi)始的一段時(shí)間里，隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)，形成的氣泡越多，高頻振蕩越劇烈，吸收的聲能越大，破壁的效果越好，因而酶的溶出量就越多［17］；但是由于超聲的強(qiáng)烈震蕩及熱效應(yīng)的作用會(huì)導(dǎo)致酶活力下降，并且細(xì)胞內(nèi)大量不溶物及較多的粘液混入提取液中，使溶液中雜質(zhì)增多黏度增大，從而增大了傳質(zhì)阻力影響酶的溶出，因而超聲時(shí)間亦不能過(guò)長(zhǎng)。

2.1.3 超聲溫度對(duì)提取酶活的影響

圖3顯示的是超聲溫度對(duì)提取酶活的影響。

圖3 超聲溫度對(duì)提取酶活的影響Fig.3Effect of temperature of ultrasonic treatment on enzyme activity

如圖所示，當(dāng)溫度為35℃左右時(shí)，經(jīng)超聲處理的酶活性最大，而低于35℃或高于35℃時(shí)，均表現(xiàn)為酶活的下降，因此最佳超聲溫度在35℃左右。這可能是由于溫度偏低，酶的活性較低；而超過(guò)一定溫度后，則會(huì)破壞酶的空間構(gòu)象［18］，造成酶的活性成分被破壞，使酶的活性降低，同時(shí)使雜質(zhì)的溶出量增加，也阻礙了酶促反應(yīng)的進(jìn)程，降低了反應(yīng)速率。

2.2 正交試驗(yàn)

由單因素所做結(jié)果，選出最佳數(shù)據(jù)，根據(jù)正交組合的原則，每個(gè)因素選出由最佳數(shù)據(jù)組成的三個(gè)水平，組成四因素三水平的正交表，如表1所示。

表1 正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 1Results and analysis of thogonal test

由表1可知，3個(gè)因素對(duì)提取效果的影響主次順序?yàn)椋撼暅囟龋境晻r(shí)間＞固液比，因此正交實(shí)驗(yàn)的最佳條件是溫度30℃、時(shí)間30 min、固液比1∶30；對(duì)正交優(yōu)化后所選擇的工藝條件進(jìn)行了驗(yàn)證（見(jiàn)表2所示），結(jié)果表明：此條件下所得酶活為4 033 U/mL。

表2 正交試驗(yàn)的最佳工藝條件測(cè)定結(jié)果Table 2Results of optimum condition from thogonal test

3結(jié)論

應(yīng)用超聲誘導(dǎo)法對(duì)大豆中脂肪氧合酶進(jìn)行了粗提，考察了超聲溫度、時(shí)間和固液比對(duì)提取大豆中脂肪氧合酶的影響，并進(jìn)行了正交試驗(yàn)以得到最佳提取工藝條件；單因素影響最佳工藝條件為超聲溫度35℃、時(shí)間25 min、固液比1∶25（g∶mL）；正交試驗(yàn)最佳工藝條件為超聲溫度30℃，時(shí)間30min，固液比1∶30（g∶mL），此條件下所得酶活為4 033 U/mL，因此這種方法更簡(jiǎn)單迅速，提取率也更高。

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Extraction of Lipoxygenase from Soybean by Ultrasonic Treatment

DING Wen-wu1，MENG Li2，CONG Lin-na3，XIA Yun-kong4
（1.School of Bioengineering，Xihua University，Chengdu 610039，Sichuan，China；2.Shan Dong Sntion Group Co.，Ltd.，Dongying 257500，Shandong，China；3.Shanghai Advanced Research Institute，Chinese Academy of Sciences，Shanghai 201210，China；4.College of life Science，Sichuan University，Chengdu 610065，Sichuan，China）

The influence factors including extraction temperature，time and solid-to-liquid ratio were studied by single factor test and orthogonal test to obtain the optimum conditions of extracting lipoxygenase in soybean by ultrasonic Treatment.The optimum conditions of extracting lipoxygenase in soybean，determined by single factor test，were as follows：extraction temperature 35℃，time 25 min and solid-to-liquid ratio 1∶25 g∶mL. On the basis of the single factor test，orthogonal test was carried out and the results showed that the optimum conditions were extraction temperature 30℃，time 30 min and solid-to-liquid ratio 1∶30 g∶mL，on which the enzyme activity was 4 033 U/mL.It was simple and fast to extract lipoxygenase in soybean by ultrasonic treatment，and the exaction rate was also higher.

soybean；lipoxygenase；ultrasonic wave；extraction

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.09.014

2014-08-19

四川省教育廳一般項(xiàng)目（15ZB0126）；西華大學(xué)2014年校重點(diǎn)科研基金項(xiàng)目（z1420523）

丁文武（1980—），男（漢），講師，博士，研究方向：酶的提取和應(yīng)用。