牛乳制品中青霉素酶Alphalisa的檢測方法

王坤

【摘要】牛奶制品中的青霉素酶是奶制品的安全風險物之一。由于青霉素的價格低廉，療效確切，經常被用來治療奶牛乳腺炎，然而，青霉素的濫用導致牛乳中的青霉素殘留已經成為廣大消費者關注的重點。青霉素酶屬于β-內酰胺酶，可水解青霉素類的β-內酰環，使青霉素水解為青霉噻唑酸。青霉噻唑酸可與T細胞表面組織相容性復合物（MHC）或與鑲嵌在細胞內的多肽結合，所形成的復合物激發T細胞，從而引起過敏反應。因此對于牛奶制品中青霉素酶進行檢測具有重要的意義。

【關鍵詞】牛乳制品；青霉素酶；Alphalisa檢測方法

一、β-內酰胺酶檢測方法及原理

現有的青霉素酶的檢測方法有碘量法、酸度法、高效液相色譜法、酶聯免疫法、頭孢硝噻吩顯色法以及杯碟法等。碘量法是《中國藥典》中規定的檢測β-內酰胺酶活性的方法，該法方便快捷、檢出限高。現階段，牛乳制品中β-內酰胺酶的檢測方法采用的是衛生部制定的《乳及乳制品中舒巴坦敏感β-內酰胺酶類物質檢驗方法杯碟法》，該方法可以檢測出生鮮乳中未反應完全的β-內酰胺酶，可用于檢測未經過任何加工的牛奶，并且檢出限較低，容易區分外源性和內源性β-內酰胺酶。其檢測原理是以一種對青霉素高度敏感的細菌作為指示菌，實驗時如果被測牛奶樣品含有青霉素酶，破壞了青霉素，指示菌株即可生長，否則指示菌將被抑制。同時，通過與標準品比對抑菌圈的大小，可以定量地確定β-內酰胺酶的含量。崔生輝等運用β-內酰胺酶特異性抑制劑舒巴坦建立了該酶的檢測方法，該方法在牛奶中的檢出限為4U/mL。目前，微生物法仍然是實驗室檢測牛奶中β-內酰胺酶的主要方法。

二、材料和方法

（一）材料和試劑

青霉素酶（P0389，sigma）；Zeba Spin 脫鹽柱（89889，Thermo Scientific）；青霉素酶抗體（ab12251，Abcam）；青霉素酶（ab10712，Thermo Scientific）；Chroma Link? Biotin （B-1001-010， Solulink）；雞抗鼠 IgG （ab6706，Abcam）；Alpha Screen? Streptavidin Donor beads（6760002，perkinelmer）；Alpha Screen? Unconjugated Acceptor Beads（6762001，perkinelmer）。

（二）方法

2.1抗原的純化及生物素化

抗原的純化：將青霉素酶溶解于修飾緩沖液（100mmol/L 磷酸鈉，150mmol/L NaCl， pH8.0）中， 用Zeba Spin脫鹽柱進行液體交換和脫鹽凈化。凈化過程：取出低溫保存的脫鹽柱，回復室溫，去掉脫鹽柱底端封口帽，開蓋，將柱子放入收集管中。4℃，1500r/min離心2min，去除保存液。向柱子中加入合適體積的待交換溶液，洗柱，4℃，1000r/min 離心2min，重復2～3次。將柱子放入新的收集管中，慢慢將適量的樣品注入樹脂的中心位置。5mL的柱子上樣量為500～2000?L。4℃，1000r/min離心2min，收集樣品。A280nm測定蛋白濃度，并進行聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），確定蛋白的相對分子質量。

青霉素酶的生物素化：用修飾緩沖液將蛋白質量濃度調整到1～2mg/mL。計算抗原和生物素化試劑的比例，取53?L脫鹽后的抗原溶液加入4.6?L的Chromalink Biotin的二甲基甲酰胺溶液（取1mg Chromalink Biotin加入100?L無水二甲基甲酰胺中即成）中，室溫條件下結合90min。同前進行脫鹽，也交換緩沖體系為Alphalisa檢測緩沖液（含25mmol/L 4-羥乙基哌嗪乙磺酸，0.5%聚乙二醇辛基苯基醚，0.1%干酪素，1mg/mL葡聚糖T500，pH7.4）中，分光光度計測定A280nm和A354nm的值，計算摩爾替換比率。

2.2受體磁珠偶聯抗鼠IgG

取5～50?L（20mg/mL）的受體磁珠于1.5mL的離心管中，加入50?L的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）（pH 7.4），14000r/min離心15min，去上清液。現配400mmol/L NaBH3CN溶液，然后按照每5?L受體磁珠和10?L抗小鼠IgG抗體（1mg/mL）、1?L NaBH3CN、0.125?L的10%吐溫20以及3.875?L的HEPES Buffer 37℃輕柔振蕩反應18～24h。然后加入10?L 65mg/mL的CMO溶液（用800mmol/L的NaOH溶液現配現用），37℃，輕柔振蕩反應1h。然后4℃、14000r/min離心15min，去上清液，然后加入200?L的100 mmol/L Tirs-HCl（pH8.0）重懸磁珠。隨即進行10次超聲振蕩（每次1s），4℃、14000r/min離心15min，去上清液。然后加入Tirs-HCl（pH8.0）溶液，同前進行第二次超聲，離心，去上清液，加200?L的PBS（含0.05%的Proclin-300），渦旋振蕩，同前簡短超聲，避光保存。

2.3Alphalisa檢測

檢測反應體系采用反向競爭模式，檢測過程均在室溫條件下完成，具體操作如下：取青霉素酶溶解于檢測緩沖液中，然后取5?L該溶液和等體積的抗青霉素酶單克隆抗體反應1h，形成抗原抗體復合物；然后加入5?L生物素化青霉素酶反應0.5h，競爭結合游離的抗青霉素酶單抗；接著加入各5?L的抗鼠IgG包被受體磁珠工作液和鏈親和素供體磁珠工作液，避光反應0.5h，最終形成供體磁珠-生物素化青霉素酶-抗青霉素酶單抗-受體磁珠復合物。最后，在ENspire multimode reader的Alphalisa檢測模塊中，以680nm波長處的入射光下發生熒光共振能力轉移，單體氧傳遞到受體磁珠上，同步激發波長615nm的發射光，記錄反應的信號值。

三、結論

青霉素酶的殘留給乳制品的質量安全帶來了極大的危害。將Alphalisa檢測方法應用于青霉素酶的檢測主要的挑戰是基質樣品的復雜性。在Mechaly等的實驗結果表明Alphalisa法可以克服基質樣本的復雜性。該研究將Alphalisa方法應用于環境樣品中炭疽孢子的檢測，靈敏度達到106孢子/m L。本研究的結果也表明，不同的牛乳制品對反應均有一定程度的抑制，但是通過離心、過濾的處理后，都能在一定的濃度范圍內呈現良好的線性反應規律。由于Alphalisa檢測反應一直處于均相的液體環境下反應，檢測限低于常規的同類方法。由于沒有洗板的過程，Alphalisa檢測的時間大大縮短，比常規酶聯免疫吸附方法縮短1～2 h。由此可見，Alphalisa方法在復雜樣品中進行快速、高靈敏度的檢測能力極強，有望成為常規酶聯免疫吸附方法的替代方法。