槲皮素對葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺乏者紅細胞的體外氧化作用

陳 麗　董金濤

（1 廣州市白云區人民醫院藥劑科，廣東 廣州 510500；2 廣州市白云區第一人民醫院，廣東 廣州 510080）

槲皮素對葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺乏者紅細胞的體外氧化作用

陳 麗1董金濤2

（1 廣州市白云區人民醫院藥劑科，廣東 廣州 510500；2 廣州市白云區第一人民醫院，廣東 廣州 510080）

目的 探討槲皮素對葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（G6PD）缺乏者紅細胞氧化還原狀態的影響。方法 分別在體外將低、中、高濃度的槲皮素與G6PD缺乏者及正常者的40%紅細胞懸液和全血進行孵育，然后測定紅細胞還原性谷胱甘肽（GSH））及高鐵血紅蛋白（MetHb）水平的變化。結果槲皮素具有較強氧化作用，能明顯降低G6PD缺乏者紅細胞GSH水平，升高MetHb，且這種氧化作用呈一定濃度依賴性，在中、高濃度表現明顯。結論槲皮素對G6PD缺乏者紅細胞具有氧化作用，G6PD缺乏者應慎用含槲皮素成分的食物、中草藥及制劑。

葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺乏；槲皮素；氧化作用；還原性谷胱甘肽；高鐵血紅蛋白

槲皮素是一種具有多種生物活性黃酮類化合物［1］，屬于黃酮類化合物中的黃酮醇，可保護機體免受活性自由基的侵害，廣泛存在各種食物、化學藥物及100種中草藥中，如水果、酒、茶、刺五加、銀杏葉等。近期研究顯示槲皮素也具有氧化作用，同時可導致紅細胞凋亡和氧化損傷。葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（G6PD）缺乏癥是一種常見的遺傳性疾病，也是世界上最多見的紅細胞酶病，據統計全球約有近4億人G-6-PD缺陷，給社會和家庭帶來了沉重的經濟負擔。我國分布規律呈“南高北低”的態勢，長江流域以南，尤以廣東、海南、四川等地為高發區，發生率為4%～15%，個別地區高達40%。本病是由于調控G-6-PD的基因突變所致，包括伯氨喹啉型藥物性溶血性貧血或蠶豆病，感染誘發的溶血，新生兒黃疸等，其中新生兒黃疸和溶血性貧血為其主要臨床表現［2］。那么G6PD缺乏者是否可接觸槲皮素類藥物及含槲皮素類食物呢？迄今尚無文獻報道。本實驗分別在體外將低、中、高濃度的槲皮素與G6PD缺乏者及正常者的40%紅細胞懸液和全血進行孵育，然后測定紅細胞還原性谷胱甘肽（GSH）及高鐵血紅蛋白（MetHb）水平的變化，為G6PD缺乏者安全使用槲皮素提供依據。

1　材料與方法

1.1研究對象（研究方案報醫院倫理委員會審批并簽訂知情同意書）：①收集于我院住院的G6PD缺乏患者15例，入選標準：G6PD活性活性＜6.7 U/gHb；男性，年齡18～60歲，無其血液系統疾病。②招募健康正常人15例，入選標準：G6PD活性活性＞6.7 U/gHb；年齡18～60歲，血常規及肝腎功能檢查正常；無溶血、感染性疾病病史，無其他血液系統疾病，愿意配合完成試驗。

1.2材料與儀器：槲皮素（98.5%、批號：201906-202602）購自Sigma Aldrich公司；α-萘酚（純度≥96%批號：1542551，2500815）購自Sigma Aldrich公司；二甲基亞砜（DMSO）購自廣州化學試劑公司、G-6-PD缺乏癥診斷試劑盒（批號：20120803）購自廣州科方醫療、谷胱甘肽試劑盒（批號：201200816）購自南京建成生物工程研究所、血紅蛋白試劑盒（批號：20200925）購自上?？菩郎锛夹g研究所；7170A全自動生化分析儀購自日立公司；UV-2550紫外可見分光光度計購自島津公司；sysmex XE-2100全自動血細胞分析儀。

1.3試劑的配備二甲基亞砜（DMSO）：配成1、5、10 mol/L儲備液；α-萘酚：用DMSO配制成0.4 mmol/L儲備液，臨用前將各儲備液用5 mmol/LPBS稀釋成50%備用。

1.4方法

1.4.1樣本采集采集肘靜脈處血液2～3 mL置于內含EDTA真空管內（BD公司生產）；為防止溶血的發生，于常溫下1～2 h內或4 ℃冰箱內可延長至4 h內進行處理；使用離心機分離血清，條件為4 ℃，3000 rprn，10 min；④為防止重復實驗過程中反復凍融導致蛋白質損失，將血清分裝至三個管內，凍存于-80 ℃冰箱內。⑤采血后12 h之內要完成血常規、G6PD活性測定、肝腎功能及藥物體外孵育試驗。

1.4.2G6PD活性測定：①EDTA-K2抗凝血以4000 r/min離心5 min，避開血漿層準確吸取壓積紅細胞20 μL加入1 mL溶解液溶解，待紅細胞完全溶解后（約1～2 min）上機測定；②參數設定：試劑（1）220 μL，試劑（2）25 μL；試驗溫度37 ℃；主/副波長340/660 nm；反應時間10 min；計算因數209084，結果以U/L表示。應用全自動血細胞分析儀測定Hb（g/L），取EDTA-K2抗凝血2 mL，進樣量約200 μL。最終，G6PD活性=G-6-PD（U/L）/Hb（g/L），結果以U/gHb表示。

1.4.3藥物體外孵育試驗全血離心后，分離血漿和白細胞層。壓積用4 ℃ PBS洗滌3次后，以40%體積重新懸浮于PBS中制備40%紅細胞懸液；加入槲皮素使終濃度為50、250、500 μmol/L；同時設立α-萘酚組（0.02 mg/mL）、DMSO組（5%）和PBS組；孵育管置于37 ℃水浴中，振蕩孵育2 h。同時，將未處理的全血直接與藥物孵育，藥物終濃度及對照組的設置同上。

表1　α-萘酚、DMSO、PBS對紅細胞GSH和MetHb的影響（，n=10）

表1　α-萘酚、DMSO、PBS對紅細胞GSH和MetHb的影響（，n=10）

注：與正常者比較，aP＜0.05，bP＜0.001；與DMSO組比較，cP＜0.001與40%紅細胞懸液中比較

孵育體系　組別　α-萘酚組　DMSO組　PBS組GSH（mg/dLRBC）　MetHb/%　GSH（mg/dLRBC）　MetHb/%　GSH（mg/dL RBC）　MetHb/% 40%紅細胞懸液　缺乏者　28.1±4.6c　7.59±1.8　37.7±6.5b　0.52±1　34.3±6.4b　0.59±1.2正常者　49.6±6.5　4.88±2.5c　52.2±7.3　0.42±1.3　50.3±6.3　0.51±1.4全血　缺乏者　27.9±7.7cd　2.65±1.8ce　31.9±7.7b　0.76±1.5　35.8±7.8b　0.79±1.2正常者　54.6±6.9　1.77±1.4　55.5±6.6　0.71±1.5　53.6±6.5　0.83±0.5

1.4.4GSH及MetHb測定孵育后的血樣離心（2000 r，10 min），取紅細胞以1∶2500比例加入純化水中制備溶血液。區溶血液用比色法對GSH進行定量測定；溶血中MetHb以加入氰化鉀前后630 nm處吸收光度的差值作為定量依據，測定MetHb所占比。

1.5統計分析：應用SPSS13.0統計分析軟件對實驗數據進行分析，數據以均值±標準差表示。兩組間的比較采用兩獨立樣本t檢驗進行分析，P＜0.05被認為差異有統計學意義。

2　結　果

2.1受試者一般情況：G6PD缺乏組G6PD活性（0.3±0.39）U/gHb，正常組（13.8±2.5）U/gHb， G6PD缺乏組G6PD活性顯著低于正常組，差異有統計學差異（P＜0.05）。

2.2α-萘酚及DMSO對紅細胞GSH和MetHb的影響；把實驗分為α-萘酚組、DMSO組和對照組，分別用α-萘酚、DMSO和PBS進行干預。結果顯示，α-萘酚組和DMSO組中，G6PD缺乏者及正常者紅細胞的GSH和MetHb存在明顯差異，差異具有統計學差異，P＜0.05。見表1。

2.3不同濃度的槲皮素對正常者及G6PD缺乏者的紅細胞GSH和MetHb的影響（，n=15）。在40%紅細胞懸液中，低濃度槲皮素對正常的紅細胞GSH水平無影響，MetHb稍增高，沒有明顯差異（P＞0.05），中、高濃度對G-6-PD缺乏者紅細胞GSH活性明顯下降（P＜0.001），而MetHb水平明顯上升（P＜0.001）。見表2。

表2　40%紅細胞懸液中槲皮素對G-6-PD缺乏者正常紅細胞GSH和MetHb的影響

2.4全血中不同濃度的槲皮素對正常者及G6PD缺乏者的紅細胞GSH和MetHb的影響。槲皮素對G6PD正常紅細胞GSH水平無影響，MetHb水平稍增高，但增高無明顯差異，對G-6-PD缺乏者紅細胞GSH活性水平明顯下降（P＜0.01），MetHb水平明顯上升（P＜0.001）。見表3。

表3　全血中不同濃度的槲皮素對正常者及G6PD缺乏者的紅細胞GSH和MetHb的影響

3　討　論

槲皮素為五羥黃酮，其分子中2、3位間有雙鍵，37、47位處有2個羥基故具有能作為金屬螯合作用或油脂等氧化過程中產生的游離基團接受體的功能，可作為油脂、抗壞血酸的抗氧化劑。

槲皮素的功能研究主要側重于其抗氧化作用，但槲皮素對體內紅細胞的氧化作用則知之甚少，尤其對G6PD缺乏者。另外，紅細胞的氧化性損傷具有累積效應，也就是說長期使用一些強化劑，累積到一定程度后會發生溶血反應等。因此應全面了解槲皮素功能。由此可見了解槲皮素對體內紅細胞的氧化作用具有重要的意義。目前關于槲皮素對紅細胞氧化作用機制尚未明確，有的認為槲皮素親脂性較大，可通過細胞膜而直接氧化Hb；有的認為其含黃酮醇形成的不穩定酚自由基或自氧化產物具有氧化作用，對G6PD缺乏者由于沒有足夠抗氧化物質，槲皮素極易造成紅細胞損傷。

抗氧化物質、脂質及蛋白等物質會富含于正常人的血漿中，從而保證了在全血中的紅細胞不易被氧化。因此正常人使用含槲皮素食物不易產生這些氧化作用。據報道紅細胞的壓積與其對抗氧化物損害的能力密切相關，紅細胞的壓積大小與其損失程度呈反比。因此本實驗設置40%紅細胞懸液孵化體系。表1顯示α-萘酚干預組G6PD缺乏者發生溶血性貧血，紅細胞水平顯著降低，MetHb水平明顯升高；而對G6PD正常者GSH水平無影響，但紅細胞MetHb升高，因為體外高鐵血紅蛋白在體外無遞氫體亞甲藍參與不能還原。至于槲皮素的試驗濃度（50、250、500 μmol/L）是根據以下依據設定的：參考其他相關研究中槲皮素應用的濃度、結合臨床可能達到濃度范圍，經預實驗設定。

結果顯示，槲皮素的氧化作用與其濃度密切相關，呈一定濃度依賴性，中濃度下已可對G6PD缺乏者紅細胞造成較大的氧化性損傷，高濃度下這一損傷更明顯（P＜0.001）。在食物中，所含槲皮素量少，G6PD缺乏者飲食攝入量不至于對其紅細胞造成損傷。另外，在常用中藥材或口服液中，由于槲皮素的含量較高，G6PD缺乏者要慎用。

本實驗通過體外試驗考察了槲皮素對G6PD缺乏者紅細胞的氧化作用，我們把實驗分為α-萘酚組、DMSO組和對照組，分別用α-萘酚、DMSO和PBS進行干預，結果顯示，α-萘酚組和DMSO組中，G6PD缺乏者及正常者紅細胞的GSH和MetHb存在明顯差異，差異具有統計學差異。有報道稱槲皮素、黃芩素等9中黃酮類可不同程度地增加G6PD缺乏者紅細胞的氧化性壓力，造成了一定氧化性損傷，這給我們臨床用藥帶來了很大的啟示，也就是說對于G6PD缺乏者來說槲皮素、芹菜素等9中黃酮類是要謹慎使用的。G6PD缺乏癥是新生兒病理性黃疸的主要原因。因此，對于G6PD缺乏者的新生兒、兒童來說，要謹慎使用大劑量應用富含槲皮素的中草藥和中草藥制劑［4］。

［1］譚君，王伯初，祝連彩.槲皮素金屬配合物的藥理作用研究進展［J］.中國藥學雜志，2006，41（22）:1688-1691.

［2］常富興，湯林華.葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺乏癥的研究進展［J］.國際醫學寄生蟲病雜志，2007，34（3）:128-129.

［3］譚毅菁，招鉅泉.兩種檢測方法對G6PD活性檢測的比較［J］.中國醫學工程，2012，20（2）:68-69.

［4］吳彤華，朱元昌.葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺乏癥基因診斷方法的建立［J］.臨床檢驗雜志，2014，32（4）:188-192.

Effect of Quercetin on Red Blood Cells Lack of Glucose -6-phosphate Dehydrogenase in Vitro

CHEN Li1， DONG Jin-tao2
（1 Department of Pharmacy， Baiyun District People's Hospital of Guangzhou， Guangzhou 510500， China； 2 The First People's Hospital of Baiyun District Guangzhou， Guangzhou 510080， China）

Objective To study the effect of quercetin on REDOX state of red blood cells lack of glucose-6-phosphate dehydrogenase （G6PD）. Methods In vitro incubation， low， medium and high concentration of quercetin， respectively cultured with G6PD deficient and normal red blood cells， red blood cell suspension at 40% and in whole blood， to detect the reducing glutathione（GSH） and methemoglobin （MetHb） levels of red blood cells. Results Quercetin is of strong oxidation， can significantly reduce the GSH level of G6PD deficient erythrocyte， elevate MetHb level. This oxidation was of concentration dependence，especial performance in the medium and high concentration of quercetin. Conclusion Quercetin is of oxidation on the red blood cells lack of G6PD.The patients with G6PD deficient should be careful with food，herbal medicine and pharmaceutics containing quercetin composition.

Lucose-6-phosphate dehydrogenase； Quercetin； Oxidation； Reducing glutathione； Methemoglobin

R446.1

B

1671-8194（2015）16-0014-02