RACK1與冠心病的關系

王正忠　張俊義　戴紅艷　邢明清　管 軍*

（青島市市立醫院心內科，山東 青島 266011）

RACK1與冠心病的關系

王正忠張俊義戴紅艷邢明清管 軍*

（青島市市立醫院心內科，山東 青島 266011）

目的 觀察冠狀動脈粥樣硬化性心臟病患者外周血中活化的蛋白激酶C受體1（RACK1）的表達，以及探討RACK1與冠心病的關系。方法選取住院行冠狀動脈造影后確診為冠心病的患者40例，以及40例健康者作為對照組，實時熒光定量PCR法測定患者外周血中單個核細胞RACK1 mRNA表達，應用免疫印跡法測定外周血中單個核細RACK1蛋白表達。結果冠心病（CHD）組患者外周血單個核細胞RACK1 mRNA表達明顯高于對照組［（12.56±2.07）比（3.13±0.96），P＜0.01）］，CHD組患者外周血單個核細胞RACK1的蛋白表達明顯高于對照組［（3.45±0.87）比（0.76±0.13），P＜0.01］。結論冠心病患者外周血中RACK1在基因和蛋白水平均明顯升高，提示RACK1在粥樣硬化的發病過程中發揮了重要作用。

冠狀動脈粥樣硬化；活化的蛋白激酶C受體1

冠狀動脈粥樣硬化性心臟病是嚴重威脅人類健康的疾病之一，近年來發病率有明顯上升趨勢，其重要的病理基礎是粥樣硬化的形成，目前針對粥樣硬化形成的學說眾多，而從分子生物學的角度以上述學說為依據，尋找粥樣硬化形成過程中相關蛋白以及大分子物質的活性改變與相互作用，從而為藥物治療尋找關鍵靶點，一直都是研究的重點。活化的蛋白激酶C受體1（receptor for activated C kinase 1，RACK1），屬于Trp-Asp40（WD40）家族，具有7個高度保守的WD40結構域，相對分子質量為36 KDa［1-2］。RACK1最早被發現能與PKC結合，因此得名。RACK1作為一種支架蛋白，可以為其他蛋白的相互作用提供一個操作界面，也可以調節其他蛋白的活性，因此它是細胞內信號通路活化以及行使功能的重要蛋白。RACK1在體內廣泛表達，主要參與調控胚胎的發育，細胞的生長、分化、遷移，細胞的凋亡，細胞的晝夜節律等［3］。已有研究表明PKC的升高在動脈粥樣硬化過程中發揮重要的作用［4］，而RACK1是PKC的錨定蛋白，因此RACK1是否在動脈粥樣斑塊形成過程中發揮重要作用需要進一步研究。

1　資料與方法

1.1研究對象：入選2014年8月至2015年1月住院的40例行冠狀動脈造影檢查，確診為冠狀動脈粥樣硬化性心臟病的患者為研究對象，其中男性26例，女性14例，平均年齡（56.7±12.3）歲，病程（3.5±0.6）年。根據臨床癥狀分為冠心病（Coronary heart disease，CHD）組40例，所用患者均排除了腫瘤、結締組織病、急慢性感染性疾病等可能影響RACK1表達的疾病，另外選擇同期體檢健康的40例健康者為對照組。

1.2血樣采集：所有組患者均空腹采集靜脈血后，分別進行實時熒光定量PCR檢測和免疫印跡檢測。

1.3實時熒光定量PCR（real-time PCR）測定RACK1的mRNA水平：所有患者采集靜脈血后，用人淋巴細胞分離液分離外周血單個核細胞，加入1 mL Trizol，提取外周血單個核細胞總RNA。提取RNA后，再經1%瓊脂糖凝膠電泳驗證和反轉錄，模板RNA在37 ℃孵育1 h。通過反轉錄得到的mRNA進行實時PCR擴增，反應條件為：94 ℃預變性30 s，94 ℃ 15 s、59 ℃ 15 s和72 ℃ 30 s（40個循環）。擴增儀為伯樂Icycler定量PCR儀。CT值由PCR儀操作軟件給出。

1.4免疫印跡測定RACK1蛋白表達：用淋巴細胞提取液提取外周血單個核細胞，細胞全蛋白提取試劑盒提取蛋白，BCA法蛋白定量，各取20 μg，進行12% SDS-PAGE電泳，轉PVDF膜。轉膜根據預染Mark觀察轉膜效果。按照相對分子質量大小將PVDF膜裁成適當形狀放入含有5 mL/LTween-20的PBST中，洗膜5 min；然后封入含有50 g/L脫脂奶的暗盒中，室溫緩慢搖動60 min；PBST洗膜5 min×3次，分別加入按1∶500稀釋于PBST的一抗rack1兔mAb（北京博奧森生物技術有限公司）和1∶500抗Actin 兔mAb（北京博奧森生物技術有限公司），4 ℃過夜；PBST洗膜5 min×3次，加入按1∶2000稀釋于PBST的二抗（辣根過氧化物酶標記羊抗兔，北京博奧森生物技術有限公司），37 ℃緩慢搖動60 min；化學發光法成像。應用圖像分析儀測定各條帶的吸光度值（A值），以RACK1（A值）/Actin（A值）的結果作為RACK1蛋白表達的相對含量。

1.5統計學分析：應用SPSS17.0軟件，多組樣本計量資料比較采用單因素方差分析，計數資料的比較采用χ2檢驗，P＜0.05為有統計學差異。

2　結　果

2.1兩組之間患者的年齡、性別、體質量等無統計學差異（P＞0.05）。

2.2實驗結果顯示外周血單個核細胞中RACK1的mRNA表達，CHD組明顯高于對照組（P＞0.01）。外周血單個核細胞中RACK1蛋白的表達，CHD組明顯高于對照組（P＞0.01）。見表1。

表1　兩組間檢測指標結果比較（）

表1　兩組間檢測指標結果比較（）

注：*P＜0.01，與對照組比較；#P＜0.01，與對照組比較

組別　例數　RACK1 mRNA　RACK1蛋白CHD組　40　12.56±2.07　3.45±0.87對照組　40　3.13±0.96*　0.76±0.13#

3　討　論

我們的研究中發現，冠狀動脈粥樣硬化患者外周血中RACK1的mRNA水平以及蛋白表達均明顯高于對照組（P＜0.01），從而提示RACK1表達增多與粥樣硬化過程存在相關性。

冠狀動脈粥樣硬化的發病機制曾有多種學說，包括脂質浸潤學說、血栓形成學說、平滑肌細胞克隆學說等，分別從不同角度對粥樣硬化成因加以闡述，近年來多數學者支持內皮損傷反應學說，其核心內容是各種危險因素最終損傷動脈內膜，在血脂參與下造成內皮、內膜損傷，引起炎癥-纖維增生性反應。RACK1參與調節多條炎癥信號通路，如JNK，GSK3β。在人單核細胞中通過病毒感染的方法敲低RACK1的含量，RACK1缺失后導致MAPK炎性信號通路中多種蛋白磷酸化水平下降，同時導致NF-κB的上游蛋白激酶磷酸化水平降低，并且影響炎性信號通路中多種蛋白表達水平降低，最終影響了炎性細胞因子IL-6和TNF-α表達下降，從而降低炎性反應。在腫瘤研究中發現，RACK1可在腫瘤細胞的黏附及遷移過程中發揮調節作用［5］，研究發現MAPK和P13K等通路在細胞黏附以及遷移過程中發揮了重要作用，在這些通路中許多重要激酶和磷酸酶的腳手架蛋白正是RACK1［6］。

根據上述研究我們可以推測RACK1在冠狀動脈粥樣硬化的炎性反應中以及巨噬細胞、平滑肌細胞的遷移過程中也發揮了類似的作用。我們的研究也證實了冠狀動脈粥樣硬化患者外周血中RACK1從基因和蛋白水平均明顯增高。其機制可能是RACK1高表達引起炎性反應中的關鍵酶活性增高，從而加速了粥樣硬化的進展，造成了斑塊的不穩定［7-8］。此外，Wang等人在RACK1與腫瘤的研究中發現，RACK1可以通過激活內皮細胞中的P13K、Akt、Rac1通路從而促進腫瘤組織中新生血管的產生［9］。因此我們推測由于在急性冠狀動脈綜合征（ACS）患者中RACK1有更高的表達，從而可能導致ACS患者粥樣硬化斑塊中新生血管更加豐富，更易破裂，從而導致板塊不穩定。

綜上所述，RACK1在冠狀動脈粥樣硬化的發展過程以及斑塊的穩定性性方面可能起到了重要的作用，下一步的研究可以考慮敲低RACK1的含量以進一步觀察其對斑塊體積以及穩定性的影響。

［1］Del Vecchio I，Zuccotti A，Pisano F，et al.Functional mapping of the promoter region of the GNB2L1 human gene coding for RACK1 scaffold protein［J］.Gene，2009，430（1/2）:17-29.

［2］Wang S，Chen JZ，Zhang Z，et al.Cloning，expression and genomic structure of a novel human GNB2L1 gene，which encodes a receptor of activated protein kinase C（RACK）［J］.Mol Biol Rep，2003，30（1）:53-60.

［3］Nakashima A，Chen L，Thao NP，et al.Rack1 functions in rice innate immunity by interacting with the rac1 immune complex［J］.Plant Cell，2008，20（8）:2265-2279.

［4］Siriker O，Ozer NK，Azzi A.Dietary cholesterol-incluced changes of protein kinase C and the effect of vitamin E in rabbit aortic smooth muscle cells［J］.Atherosclerosis，1996，126（2）:253-263.

［5］Cox EA，Bennin D，Doan AT，et al.RACKl regulates integrinmediated adhesion ，prou'usion ，and chemotactic cell migration via its Src-binding site［J］.Mol Biol Cell，2003，14（2）:658-669.

［6］huang CF，Fan JH，Chuang NN.Farnesyl pyrophosphate promotes and is essential for the binding of RACKl with beta-tubulin ［J］.J Exp Zool A Comp Exp Biol，2003，298（2）:119-127.

［7］陳文一，王紅巧，張豐雪.冠心病病人血清IMA與sI-CAM-1變化及意義［J］.青島大學醫學院學報，2009，13（6）:517-518.

［8］孫健玲，黃衛民，王崇禹，等.冠狀動脈心肌橋與冠狀動脈粥樣硬化關系的臨床研究［J］ .中國醫藥導報，2012，3（29）:57-58.

［9］Wang F，Yamauchi M，Muramatsu M，et a1.RACKI regulates VEGF/Flt1-mediated cell migration via activation of a PBK/Akt pathway［J］.J Biol Chem，2011，286（11）:9097-9106.

R541.4

B

1671-8194（2015）16-0059-02

青島市科技局科研基金資助項目（10-3-3-4-2）

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