水磨年糕中微生物的分離純化與鑒定

陳挺+婁永江+龐林江等

摘 要：通過對年糕內部和表面的微生物進行分離純化，并通過形態觀察、生化測定的方法來鑒定微生物的組成，結果表明：年糕表面的微生物主要有6種細菌、3種霉菌和2種酵母菌。細菌中4種是芽孢桿菌，分別為巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、蠟狀芽孢桿菌（Bacillus cereus）和短芽孢桿菌（Bacillus brevis），2種是非芽孢桿菌，分別為乙酰短桿菌（Brevibacterium acetylicum）和乙酸鈣不動桿菌（Acinetobacter calcoaceticus）；霉菌分別為米根霉（Rhizopus oryzae）、構巢曲霉（Aspergillus nidulans）和米曲霉（Aspergillus oryzae）；酵母菌分別為茁芽絲孢酵母（Trichosporon pullulans）和白色假絲酵母（Candida albicans）。年糕內部的微生物有巨大芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、短芽孢桿菌和白色假絲酵母，無霉菌。

關鍵詞：年糕；分離純化；微生物；鑒定

中圖分類號 R155 文獻標識碼 A 文章編號 1007-7731（2015）19-25-04

Purification and Identification of Microbes in Water Mill Rice Cake

Chen Ting1，2 et al.

（1School of Marine Sciences，Ningbo University，Ningbo 311300，China；2Jiangbei Science and Technology Bureau，Ningbo 311300，China）

Abstract：Through the morphology observation and the physiological and biochemical of microorganisms which were separated and purified from the interior and the surface of the rice cake，we can get that there were 6 kinds of bacterium（involving 4 kinds of Bacillus which were Bacillus megaterium，Bacillus subtilis，Bacillus cereus and Bacillus brevis，2 kinds of non-Bacillus were Brevibacterium acetylicum and Acinetobacter calcoaceticus），3 kinds of molds（Rhizopus oryzae，Aspergillus oryzae and Aspergillus nidulans），and 2 kinds of Yeast（they were respectively Candida albicans and Trichosporon pullulans）on the surface of rice cake.The inside microorganisms of Rice cake were Bacillus megaterium，Bacillus subtilis，Bacillus brevis and trichosporon pullulans without mold.

Key words：Rice cakes；Separation and purification；Microbes；Identification

年糕是一種歷史悠久且地方特色非常濃郁的方便性米制品[1-2]，水分含量高達45%，營養豐富。年糕在其生產過程中極易受到微生物的污染，其原輔料、加工半成品及成品都直接暴露于空氣和水中，在成熟后期的切片、晾曬和裝袋的過程中很容易受到空氣中的微生物的二次污染[3]。因此，即使是真空包裝的年糕也會因一些細菌芽孢的存在而發生腐敗。本文通過對年糕表面和內部的微生物進行分離純化及鑒定，并對年糕表面與內部的微生物進行分析比較，探索提高年糕保質期的方法，為企業開發適合年糕的保鮮措施提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑 年糕：寧波市江北慈城莊永大年糕廠提供。蛋白胨：BR，臨安木木生物技術有限公司；瓊脂：AR，臨安木木生物技術有限公司；牛肉膏：BR，杭州百思生物技術有限公司；氯化鈉：AR，西隴化工股份有限公司；葡萄糖：AR，西隴化工股份有限公司；硝酸鈉：AR，上海振欣試劑廠；磷酸氫二鉀：AR，湖州湖試化學試劑有限公司；硫酸鎂：AR，西隴化工股份有限公司；硫酸亞鐵：AR，西隴化工股份有限公司，等等。

1.1.2 儀器與設備 電熱恒溫培養箱：DRP-9162，上海森信實驗儀器有限公司；高壓蒸汽滅菌鍋：D-1，北京發恩科貿有限公司；雙人單面潔凈工作臺：SW-CJ-1CU，蘇潔凈化；氣浴恒溫振蕩器：ZD-85A，金壇市科析儀器有限公司；精密電子天平：JJ300，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；雙目生物顯微鏡：BA210，麥克奧迪實業集團有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 微生物的分離純化 各取真空包裝年糕的表面與內部的年糕25g，磨碎后放入225mL無菌水中，恒溫氣浴震蕩24h，取上清液在培養基上進行稀釋平板分離[4]，挑選形態不同的優勢菌株的單菌落進行劃線分離，純化培養，經革蘭氏染色后用顯微鏡觀察菌株。

1.2.2 微生物的鑒定

1.2.2.1 細菌的鑒定 主要參考《伯杰細菌鑒定手冊（第八版）》[5]中的方法。通過對細菌的菌落特征、細胞形態及生理生化實驗來鑒定細菌種類。細菌形態觀察的主要操作是挑取長勢較好的單一菌落進行革蘭氏染色、鞭毛染色和芽孢染色，并觀察細菌細胞的形狀和細菌細胞間的排列方式[6]。生理生化實驗主要包括過氧化氫酶的測定、甲基紅試驗（M.R試驗）、乙酰甲基甲醇試驗（V.P試驗）、淀粉水解試驗和糖發酵試驗。

1.2.2.2 霉菌的鑒定 參考沈源[7]和俞科偉[6]等的鑒定方法。通過肉眼觀察菌落的顏色、表面特征、生長速度等；通過顯微鏡觀察個體細胞的菌絲、子實體、孢子等的形態[8]。

1.2.2.3 酵母菌的鑒定 參考Lodder與Barnit的鑒定方法[9-10]。形態觀察主要包括對菌落、細胞形態、子囊孢子、假菌絲、擲孢子等的觀察。生理實驗主要是糖發酵實驗、同化實驗、硝酸鉀同化實驗、類淀粉物質的形成等。

2 結果與分析

2.1 微生物的分離純化 本試驗在年糕表面分離純化得到6種細菌、3種霉菌和2種酵母菌，分別編號為A1、A2、A3、A4、A5、A6；B1、B2、B3；C1、C2。在年糕內部分離純化得到3種細菌和1種酵母菌，無霉菌，分別編號為D1、D2、D3；E1。

2.2 微生物的鑒定結果

2.2.1 細菌鑒定結果 對年糕表面分離純化的細菌的菌落特征進行觀察，并用顯微鏡油鏡對其經革蘭氏染色后觀察，結果見表1。由表1可知，A1、A2為非芽孢桿菌，A3、A4、A5、A6為芽孢桿菌。根據進一步觀察分析（表1，圖1），可以確定A1屬于革蘭氏陰性球菌和球桿菌部分，對其進行氧化酶實驗，表現為陰性，因此確定A1屬不動桿菌屬，而A1的形態與《伯杰細菌鑒定手冊》中不動桿菌屬中的乙酸鈣不動桿菌種基本一致，因此確定A1為乙酸鈣不動桿菌。

表1 細菌菌落特征及顯微鏡觀察結果

[菌株＼& 菌落特征 ＼& 顯微鏡觀察 ＼&表面特征＼&好氧性＼&顏色＼&革蘭氏

染色＼&有無

芽孢＼&大小（μm×μm）＼&A1＼&圓形，光滑，

邊緣整齊＼&好氧＼&白色＼&G-桿菌＼&無＼&1.1×2.0＼&A2＼&圓形，光滑，有光澤，濕潤，邊緣整齊＼&好氧＼&灰白色＼&G+桿菌＼&無＼&0.6×0.8＼&A3＼&圓形，光滑，濕潤，

邊緣規則齒狀＼&好氧＼&白色＼&G+桿菌＼&有＼&1.4×2.7＼&A4＼&圓形，表面粗糙，

不規則，似蠟狀＼&好氧＼&白色＼&G+桿菌＼&有＼&1.0×3.2＼&A5＼&圓形，光滑，濕潤，

邊緣為規則齒狀＼&好氧＼&乳白色＼&G+桿菌＼&有＼&0.8×2.1＼&A6＼&圓形，表面色暗，

變厚，不透明，

光滑有光澤＼&好氧＼&白色＼&G+桿菌＼&有＼&0.8×1.6＼&]

根據形態觀察可以確定A2屬于短桿菌屬（表1，圖2），對其進行鞭毛染色證明該菌有鞭毛，而其過氧化氫酶試驗呈陽性，結合《伯杰細菌鑒定手冊》，確定A2為短桿菌屬未知的種里面的乙酰短桿菌。

<＼＼Pc10＼工作盤 （E）＼姜秀紅＼雜志＼安徽農學通報雜志＼2015-19農學通報內文＼8608-1.tif>圖1 A1顯微鏡觀測結果

<＼＼Pc10＼工作盤 （E）＼姜秀紅＼雜志＼安徽農學通報雜志＼2015-19農學通報內文＼8608-2.tif>

圖2 A2顯微鏡觀測結果

觀察發現A3、A4、A6的芽孢囊不明顯膨大，芽孢主要為橢圓形或柱狀，中生到端生，且都為革蘭氏陽性菌，因此A3、A4、A6屬芽孢桿菌屬的群1，而A5的芽孢囊比較膨大，芽孢多數為橢圓形，因此A5屬芽孢桿菌屬的群2。對這4種細菌進行生理生化試驗，結果如表2。由表2可知，A5為短芽孢桿菌，對A3、A4、A6通過美藍淡染色進行區分，發現A3、A4的原生質中有不著色的顆粒，結合表3確定A3為巨大芽孢桿菌，A4為蠟狀芽孢桿菌。對A6進行耐鹽性實驗，發現A6在7%的NaCl中生長，且可還原硝酸鹽成亞硝酸鹽，結合表2、圖3確定A6為枯草芽孢桿菌，這與胡慶松[11]通過API微生物鑒定系統鑒定的結果類似。

表2 A3、A4、A5、A6芽孢桿菌的生理生化測定結果

[試驗

項目＼&過氧化氫酶＼&淀粉

水解＼&M.R

試驗＼&V.P

試驗＼&糖發酵試驗＼&葡萄糖＼&蔗糖＼&麥芽糖＼&A3＼&+＼&+＼&+＼&-＼&+＼&+＼&+＼&A4＼&+＼&+＼&+＼&+＼&+＼&+＼&+＼&A5＼&+＼&-＼&/＼&/＼&-＼&-＼&-＼&A6＼&+＼&+＼&+＼&+＼&+＼&+＼&+＼&]

注：+為陽性，-為陰性，/為不確定。

<＼＼Pc10＼工作盤 （E）＼姜秀紅＼雜志＼安徽農學通報雜志＼2015-19農學通報內文＼8608-3-2.tif><＼＼Pc10＼工作盤 （E）＼姜秀紅＼雜志＼安徽農學通報雜志＼2015-19農學通報內文＼8608-3-1.tif>

圖3 A6菌落和顯微鏡觀測結果

采用相同方法對年糕內部細菌進行鑒定，結果表明，年糕內部的3種細菌分別為巨大芽孢桿菌、短芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌。

2.2.2 霉菌鑒定結果 對年糕表面的霉菌B1、B2、B3進一步作純化培養鑒定。B1在察氏培養基上生長迅速，培養4d后菌落直徑約為75mm，菌落呈疏松絮狀，在顯微鏡下觀察，其假根主要生長在匍匐枝的節間，孢子囊梗生長在匍匐枝的節間上面，而在梗的頂端膨大形成孢子囊，其孢子呈球形、黑褐色（圖4）。根據《真菌鑒定手冊》[12]和《微生物學實驗手冊》[13]，確定B1屬根霉屬；B1在Pfeffer氏液中45℃和37℃時分別表現為不生長和生長，且其菌絲上面有厚垣孢子，因此B1為米根霉。B2在察氏培養基上培養4d后菌落直徑14～18mm左右，14d后直徑53～60mm左右（圖5，6），生長快，開始幾天菌落為白色，慢慢變為淡黃色，最終為黃褐色，顯微鏡下觀察其孢子頭呈柱形，分生孢子梗大多數為褐色柱形，且梗頂端膨大，呈圓球形。依照國標（GB/T 4789.16-2003）[14]中描述的霉菌的特征，認定B2為曲霉屬的構巢曲霉。

<＼＼Pc10＼工作盤 （E）＼姜秀紅＼雜志＼安徽農學通報雜志＼2015-19農學通報內文＼8608-4.tif>圖4 B1顯微鏡觀測結果

<＼＼Pc10＼工作盤 （E）＼姜秀紅＼雜志＼安徽農學通報雜志＼2015-19農學通報內文＼8608-5.tif>

圖5 B2顯微鏡觀測結果

<＼＼Pc10＼工作盤 （E）＼姜秀紅＼雜志＼安徽農學通報雜志＼2015-19農學通報內文＼8608-6-2.tif><＼＼Pc10＼工作盤 （E）＼姜秀紅＼雜志＼安徽農學通報雜志＼2015-19農學通報內文＼8608-6-1.tif>

圖6 B2的足細胞

B3在察氏培養基上生長較快，菌落表面為黃綠色顆粒狀，背面無色，質地疏松，邊緣菌絲為白色，分生孢子頭呈放射狀，頂囊呈球形，小梗單層，參考《微生物學實驗手冊》，認定B3為米曲霉。同樣方法，在年糕內部成分中，沒有分離到霉菌。

2.2.3 酵母菌鑒定結果 年糕表面酵母菌C1、C2的形態特征和生理生化結果如表3。

表3 年糕表面酵母菌形態特征和生理生化鑒定結果

[特征特性＼&參考指標＼&C1＼&C2＼&形態特征＼&菌落＼&圓形，乳白色＼&圓形，乳白色＼&沉淀＼&有＼&有＼&細胞形態＼&圓形或橢圓形＼&圓形＼&醭、環、島＼&環＼&環＼&無性繁殖方式＼&芽殖＼&芽殖＼&假菌絲＼&有＼&有＼&子囊孢子＼&無＼&無＼&擲孢子＼&無＼&無＼&生理特性＼&發酵

實驗＼&葡萄糖發酵＼&+＼&-＼&乳糖＼&-＼&-＼&蔗糖發酵＼&-＼&-＼&麥芽糖發酵＼&-＼&-＼&同化

實驗＼&蔗糖同化＼&-＼&+＼&半乳糖同化＼&+＼&+＼&纖維二塘同化＼&-＼&+＼&甘露糖同化＼&+＼&-＼&鼠李糖同化＼&-＼&-＼&可溶性淀粉同化＼&+＼&-＼&纖維二塘同化＼&-＼&-＼&棉子糖同化＼&-＼&+＼&N-乙酰葡萄糖胺同化＼&-＼&-＼&松三糖同化＼&-＼&+＼&山梨醇同化＼&-＼&+＼&衛矛醇同化＼&-＼&-＼&肌醇同化＼&-＼&+＼&赤蘚醇同化＼&-＼&+＼&其他實驗＼&類淀粉化合物形成＼&-＼&-＼&KNO3同化＼&-＼&+＼&]

由表4可知，C1、C2均為多邊芽殖，均無有性繁殖，細胞圓形或橢圓形，C2有真菌絲和節孢子，因此屬于絲孢酵母屬，C1菌落無色素，有芽細胞和假菌絲，無子囊孢子，因此C1屬于假絲酵母屬（圖7），經生理特性實驗結合《微生物學實驗手冊》和《酵母菌的特征與鑒定手冊》[15]可知，C1為白色假絲酵母，C2為茁芽絲孢酵母（圖8）。

年糕內部的酵母菌E1的鑒定結果與年糕表面C1的鑒定結果一致，因此E1也是白色假絲酵母。

<＼＼Pc10＼工作盤 （E）＼姜秀紅＼雜志＼安徽農學通報雜志＼2015-19農學通報內文＼8608-7.tif>圖7 C1顯微鏡觀測結果

<＼＼Pc10＼工作盤 （E）＼姜秀紅＼雜志＼安徽農學通報雜志＼2015-19農學通報內文＼8608-8.tif>

圖8 C2顯微鏡觀測結果

3 討論

本文通過對年糕表面和內部的微生物進行分離、純化、鑒定，結果表明，年糕表面有6種桿菌（乙酸鈣不動桿菌、枯草芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、乙酰短桿菌、蠟狀芽孢桿菌和短芽孢桿菌）、3種霉菌（米根霉、構巢曲霉和米曲霉）和2種酵母菌（白色假絲酵母和茁芽絲孢酵母）；年糕內部有3種芽孢桿菌（枯草芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌和短芽孢桿菌）、一種酵母菌（白色假絲酵母）。年糕中的細菌一般是從原料流入，雖然在高溫蒸煮過程中能殺滅大部分的微生物，但并不能徹底地殺滅細菌芽孢，這是年糕腐敗的主要原因之一；年糕內部的霉菌和酵母菌種類都比表面少，說明生產中工具清洗消毒不徹底及成熟年糕在晾曬過程中其表面被存在于空氣中、年糕攤晾器械表面上的微生物污染，最終造成年糕的腐敗。由此，建議在年糕的生產過程中，要盡量做到清潔生產，從原材料到產品等各個環節做到全過程管理，滅菌前期注意芽孢桿菌的污染，滅菌后期注意控制好外界微生物的污染，則能大大提高年糕的保質期，達到延長貨架期的目的。

參考文獻

[1]婁永江，熊海維，張晶.方便年糕保鮮技術研究[J].食品研究與開發，2004，25：139-141.

[2]俞科偉，桑衛國.年糕中微生物的分離純化與鑒定[J].食品工業科技，2010，31（2）：167-169.

[3]胡慶松，劉青梅，楊性民，等.年糕腐敗菌的鑒定和菌系分析[J].食品與生物技術學報，2009，28（4）：564-568.

[4]Ji Ying，Zhu Kexue，Qian Haifeng，et al.Microbiological characteristics of cake prepared from rice flour and sticky rice flour [J].Food Control，2007，18：1507-1511.

[5]R.E.布坎南，N.E.吉本斯等.伯杰細菌鑒定手冊[M].北京：科學出版社，1987.

[6]俞科偉.方便年糕復合保鮮的研究[D].寧波：寧波大學，2009.

[7]沈源.糧食中霉菌分離與鑒定方法的初步研究[J].彭城大學學報，1997，3：62-65.

[8]徐睿烜，侯愛香，王非，范麗琴.菜籽粕中優勢微生物分析及保藏技術研究[J].食品與機械，2012，28（5）：169-173.

[9]穆文斌，余讓揚，袁志強.酵母菌的分離及其特性的研究[J].釀酒，2004，1：29-30.

[10]張紀忠.微生物分類學[M].上海：復旦大學學出版社，1990.

[11]胡慶松.年糕生產和貯藏期間微生物控制技術的研究[D].南京：南京農業大學，2009.

[12]魏景超.真菌鑒定手冊[M].上海：上海科技出版社，1979.

[13]周德慶.微生物學實驗手冊[M].上海：上海科學技術出版社，1986.

[14]GB/T 4789.16-2003.食品衛生微生物學檢驗常見產毒霉菌的鑒定[S].

[15]JA 巴尼特，佩恩，亞羅.酵母菌的特征與鑒定手冊[M].胡瑞卿，譯.青島：青島海洋大學出版社，1991. （責編：張宏民）