CBHⅡ和EGⅣ的重構基因在里氏木霉中的組成型表達

曾敏，鄧麗瑜，湯新，劉剛，余少文，*

（1.深圳大學生命科學學院，深圳市微生物基因工程重點實驗室，廣東深圳518060；2.深圳大學生命科學學院，深圳市海洋生物資源與生態環境重點實驗室，廣東深圳518060）

CBHⅡ和EGⅣ的重構基因在里氏木霉中的組成型表達

曾敏1，2，鄧麗瑜1，湯新1，劉剛1，余少文1，*

（1.深圳大學生命科學學院，深圳市微生物基因工程重點實驗室，廣東深圳518060；2.深圳大學生命科學學院，深圳市海洋生物資源與生態環境重點實驗室，廣東深圳518060）

重構基因cbh2-linker-CDeg4表達的融合蛋白同時獲得具有外切葡聚糖酶CBH II和內切葡聚糖酶EG IV 2種催化活性，在纖維素降解等方面有著重要應用。本研究通過overlap PCR將里氏木霉丙酮酸脫羧酶（PDC）的啟動子、纖維二糖水解酶cbh1的信號肽、重構基因cbh2-linker-CDeg4和pdc終止子依次連接，以質粒pPICZαA為基本骨架，構建表達載體pPIC-PCT。采用原生質體轉化法將pPIC-PCT和含潮霉素抗性篩選標記的質粒pAN7-1共轉里氏木霉。SDS-PAGE分析表明，重構基因cbh2-linker-CDeg4實現了在里氏木霉中的組成型表達，測得重組木霉發酵上清液的CMCNa酶活最高達到4.08 U/mL，是出發菌株的5.55倍，FPA酶活達到0.915 U/mL，較出發菌株提高了43.6%。酶學性質初步研究表明：粗酶液的最適pH為5.0，最適溫度為50℃。

基因重構；外切葡聚糖酶Ⅱ；內切葡聚糖酶Ⅳ；丙酮酸脫羧酶啟動子

纖維素酶能有效降解纖維素，將其水解成葡萄糖，廣泛應用于紡織、食品加工、釀酒、造紙和飼料等領域，對解決環境污染和能源危機具有重大意義［1-2］。纖維素酶廣泛存在于多種微生物中，其中里氏木霉（Trichoderma reesei）是目前研究最透徹的產纖維素酶模式菌株［3-4］，它產生的纖維素酶主要由內切型葡聚糖酶（endo-glucanases，EG）、外切型葡聚糖酶（exo-cel－lobiohydrolase，CBH）以及β-葡萄糖苷酶（β-Glucosi dase，簡稱BG）組成［5-7］，它們通過協同作用降解纖維素［8］。其中只有CBH可作用于纖維素結晶區域，從纖維素分子的非還原端進行水解，而自然界中的木質纖維素大都呈結晶狀態，因此CBH在纖維素降解過程中的作用非常重要。纖維素酶有2個活性區域：催化結構域（catalytic domains，CD）和纖維素結合結構域構（celluose-binding domains，CBD）［9-10］，其中CD是纖維素酶的“活性中心”，在水解過程中起著重要作用。

根據纖維素酶各組分間的協同作用研究，人們發現適當改變各組分的比例可提高纖維素酶的降解效率。近年來，從分子結構水平改造纖維素酶基因，提高纖維素酶的生物學活性已經取得了重大進展。Lemos［11］等在基因cbh2和eg中增加CBD基因，提高了這兩種纖維素酶的活性。劉剛等［12］在eg4基因中增加一個其自身的CD基因，使其重組蛋白活性提高了4倍。本實驗室在cbh2下游增加eg4的CD基因，得到含2個催化結構域的重構基因cbh2-linker-CDeg4。本研究將該基因與里氏木霉丙酮酸脫羧酶的組成型強啟動子（含信號肽）融合，構建里氏木霉組成型表達轉化系統，以期得到可以高效表達融合蛋白CBHⅡ-EGⅣ且具有較高酶活力的重組木霉。

1　材料與方法

1.1菌株及質粒

T.reesei QM9414、大腸桿菌E.coli Top10F’、質粒pPICZαA、pAN7-1由本實驗室保藏。pMD18-T simple vector購自TaKaRa公司。質粒pPIC-cbh2，pPIC-eg4由本實驗室前期構建。

1.2培養基

Mandels基礎培養基：Mandels營養鹽濃縮液100 mL/L，Mandels微量元素濃縮液1.0 mL/L，無水葡萄糖10 g/L，蛋白胨1.0 g/L，1 M的檸檬酸緩沖液（pH4.5）50 mL/L，吐溫80 1.0 g/L～2.0 g/L。

篩選培養基：含有STC和潮霉素100 μg/mL的PDA培養基。其中，STC、葡萄糖和PDA培養基的其他成分分為3部分各溶于約1/3的水中。

產酶培養基：50×Mandels營養鹽濃縮液20 mL/L，1 000×Mandels微量元素濃縮液1.0 mL/L，黃豆餅粉50 g/L，1 M檸檬酸緩沖液（pH 4.5）50 mL/L，吐溫80 1.0 g/L～2.0 g/L，葡萄糖30 g/L。

1.3表達載體pPIC-PCT的構建

分別以實驗室前期構建的質粒pPIC-eg4、pPIC-cbh2為模板，根據NCBI公布eg4、cbh2序列設計引物，經PCR獲得基因片段linkereg4、CDeg4和cbh2。依次經雙酶切連接至質粒pPICZαA，重構質粒pPIC-cbh2-linker-CDeg4。

以里氏木霉基因組DNA為模板，根據Genebank報道的序列設計引物，分別經PCR擴增獲得纖維二糖水解酶I信號肽序列Scbh1、丙酮酸脫羧酶啟動子Ppdc和終止子Tpdc序列。利用overlap PCR技術依次連接PSpdc、cbh2-linker-CDeg4、Tpdc，構建表達載體pPIC-PCT。

1.4里氏木霉的原生質體轉化及篩選

表達載體pPIC-PCT經Xba I酶切純化處理后，與含潮霉素篩選標記的質粒pAN7-1共轉T.Reesei，主要參照Penttila等的方法進行［13］。取適量轉化液涂布到含有100 μg/mL潮霉素的PDA平板上，28℃培養觀察3 d～5 d至平板上長出菌絲，挑取單菌落菌絲轉接至100 μg/mL潮霉素的PDA小平板上進行復篩，28℃培養2 d，再轉接至新鮮無抗性PDA小板上培養7 d～10d。

1.5重組木霉的組成型表達

用無菌水刮取PDA培養平板上生長7 d的木霉轉化子孢子，接種至含潮霉素抗性的Mandels基礎培養基中，28℃，220 r/min振蕩培養1.5 d～2 d。以5%的接種量轉接至產酶培養基中，28℃，220 r/min，振蕩培養。11 000 r/min，離心10 min，收集上清，即為粗酶液，每24 h取樣一次檢測粗酶液的酶活力。

1.6重組木霉的PCR鑒定

以重組木霉基因組DNA為模板，PCR擴增重構基因cbh2-linker-CDeg4，以木霉基因組DNA為對照，用1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測并測序。

1.7重組木霉表達產物的分析

SDS-PAGE電泳：取粗酶液進行SDS-PAGE，分析融合蛋白CBHⅡ-EGⅣ的表達情況。

CMCNa酶活的測定：采用DNS法測定內切葡聚糖酶的活性［14］，酶活力單位（U）定義為1 min水解生成1 μmol葡萄糖所需的酶量。取適當稀釋后的粗酶液0.5 mL與1%CMC-Na（用0.05 M檸檬酸緩沖液配制，pH4.8）于50℃水浴中反應30 min，立即加入3 mL DNS終止酶反應，充分混勻，沸水浴5 min，冷卻，充分混勻后測OD540。每組實驗做3個重復。

濾紙酶活（FPA）的測定：取0.5 mL適當稀釋后的粗酶液、1 mL檸檬酸緩沖液（0.05 M，pH4.8）及50 mg的濾紙條（Whatman NO.1）在50℃水浴中反應30 min，立即加入3mLDNS終止酶反應，充分混勻，沸水浴5min，冷卻，充分混勻后測OD540。每組實驗做3個重復。

1.8重組木霉酶學性質的初步研究

酶反應的最適pH：分別配制pH為3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0的0.05 mol/L的檸檬酸緩沖液，在對應pH條件下進行CMCNa酶活測定。

酶反應的最適溫度：分別在30、40、50、60、70、80℃下進CMCNa酶活測定。

2　結果與分析

2.1表達載體的構建

通過酶切連接法獲得大小為2 205 bp的重構基因cbh2-linker-CDeg4，將該基因插入PSpdc和Tpdc之間，構建表達載體pPIC-PCT，大小約為7 000 bp，其測序結果與預期相符，可用于后續轉化實驗（如圖1）。

圖1　表達載體pPIC-PCT的酶切鑒定Fig.1Enzyme digestion of the recombined plasmid pPIC-PCT

2.2重組木霉的PCR鑒定

如圖2所示：可在大部分重組木霉的基因組中擴增到重構基因cbh2-linker-CDeg4，且測序結果與預期一致，表明重構基因cbh2-linker-CDeg4已成功整合到到里氏木霉基因組中。

圖2　重組木霉基因組的PCR鑒定Fig.2Identification of recombinant T.reesei by PCR

2.3SDS-PAGE分析

融合蛋白CBHⅡ-EGⅣ在pdc啟動子的調控下，成功實現了在里氏木霉中的組成型表達。SDS-PAGE電泳分析結果表明（圖3），融合蛋白CBHⅡ-EGⅣ的分子量約為100 KD，大于理論值80.56 KD，推測是重組蛋白在表達時發生了糖基化修飾。

圖3　重組木霉的SDS-PAGE分析Fig.3Analysis of of recombinant T.reesei by SDS-PAGE

2.4重組木霉菌株的酶活測定

在相同條件下對重組木霉菌株及出發菌株進行組成型產酶實驗，測得重組木霉A4的CMCNa酶活最高，達到4.08 U/mL（圖4），是出發菌株的5.55倍。重組木霉A4的FPA酶活為0.915 U/mL（圖5），較出發菌株提高了43.6%。由于初始菌體濃度較低，前48 h內幾乎檢測不到A4的CMCNa酶活和FPA酶活，96、84 h其酶活分別達到最高。培養108 h時，CMCNa酶活和FPA酶活均下降，可能是由于融合蛋白被里氏木霉自身分泌的蛋白酶所降解。

圖4　重組木霉A4的CMCNa酶活Fig.4CMCNaactivity of recombinant T.reesei

圖5　重組木霉A4的FPA酶活Fig.5FPA activity of recombinant T.reesei

2.5酶學性質的初步研究

如圖6所示，粗酶液的最適pH為5.0，在pH為4.0～5.5范圍內相對酶活較高，pH過低或過高都對酶活有較大影響。

圖6　粗酶液的最適pHFig.6The optimum pH of crude enzyme

如圖7所示，粗酶液的最適反應溫度為50℃，在50℃～60℃范圍內相對酶活較高，在70℃時還能保持最高酶活的66.6%，當溫度達到80℃時，酶活急劇下降。

圖7　粗酶液的最適溫度Fig.7The optimum temperature of crude enzyme

3　結論與討論

纖維素酶應用廣泛，但因酶活低、成本高等因素不能進行大規模工業化生產和應用［15］。近年來，通過基因工程技術來獲得高活性、高產量的纖維素酶逐漸受到重視。本研究對纖維素酶cbh2和eg4進行重構，獲得具有2個催化結構域的重構基因，它表達的蛋白具有這2種纖維素酶組分的催化活性，在實際應用中具有更廣闊的前景。

里氏木霉能高效合成和分泌蛋白質，是高產纖維素酶的代表菌種。它常使用cbh1啟動子構建表達系統［16-18］，實現目的基因的同源或異源表達，但cbh1啟動子需要纖維素或乳糖的誘導才能調控目的基因的表達。此外，誘導物也能誘導里氏木霉其它纖維素酶的表達，加大了目的蛋白分離、純化的難度。LI等［19］通過RT-qPCR技術從里氏木霉中篩選出可以使木聚糖酶Ⅱ基因（xyn2）高效表達的pdc啟動子，且里氏木霉分泌的總蛋白中約83%是XYN2蛋白。WANG等［20］利用pdc啟動子調控康氏木霉纖維素酶轉錄激活因子xyr1的表達，結果顯著提高了纖維素酶的活性。pdc組成型啟動子所構建的表達系統無需誘導物，能在富含葡萄糖的培養條件下啟動基因的轉錄。里氏木霉自身分泌蛋白較少，能有效解決目的蛋白的分離及純化問題。本研究利用pdc啟動子實現了重構基因cbh2-linker-CDeg4在里氏木霉中的組成型表達，其CMCNa酶活達到4.08 U/mL，是出發菌株的5.55倍，FPA酶活達到0.915 U/mL，較出發菌株提高了43.6%，大大提高了酶活力。

綜上所述，重構基因cbh2-linker-CDeg4在pdc啟動子的調控下，實現了在里氏木霉中的組成型高效表達，且雜蛋白較少，容易提純。酶學性質研究表明，粗酶液的最適pH為5.0，最適反應溫度為50℃。cbh2-linker-CDeg4同時具有cbh2和eg4的催化活性，在食品、飼料、紡織等工業有著廣泛應用前景。今后，我們將對產酶培養基進行優化，通過改變對酶活影響較大的3個因素（碳源、氮源、無機鹽）來確定最優培養方案，進一步提高該融合蛋白的酶活。今后將對該蛋白進行純化，并對其酶學性質做詳細研究。

［1］邱雁臨.纖維素酶的研究和應用前景［J］.糧食與飼料工業，2001（8）：30-31

［2］伯永科，崔海信.纖維素的循環經濟效益［J］.中國資源綜合利用，2006，24（12）：14-16

［3］Sun WC，Cheng CH，Lee WC.Protein expression and enzymatic activity of cellulases produced by Trichoderma reesei Rut C-30 on rice straw［J］.Process Biochemistry，2008，43（10）：1083-1087

［4］Martinez D，Berka RM，Henrissat B，et al.Genome sequencing and analysis of the biomass-degrading fungus Trichoderma reesei（syn Hypocrea jecorina）［J］.Nat.Biotechnol，2008，26：553-560

［5］Wilson DB.Three microbial strategies for plant cell wall degradation［J］.Ann.N.Y.Acad.Sci，2008，1125：289-297

［6］Foreman，P，Brown D，Dankmeyer L，et al..Transcriptional regulation of biomass-degrading enzymes in the filamentousfungus Trichoderma reesei［J］.Biol.Chem，2003，278：31988-31997

［7］Saloheimo M，Kuja-Panula J，Yl?sm?ki E，et al.Enzymatic properties and intracellulase localization of the novel Trichoderma reesei b-glucosidase BGLII（Cel1A）［J］.Appl.Environ.Microbiol，2002，68：4546-4553

［8］Singhania RR，Sukumara RK，Patel AK，et al.Advancement and comparative profiles in the production technologies using solidstate and submerged fermentation for microbial cellulases［J］.Enzyme Microb Technol，2010，46：541-549

［9］Pentila M，Lehtovaara P，Nevalainen H，et al.Homolgy between cellulase genes of Trichoderma reesei：compete nucleotide sequence of endoglucanase I gene［J］.Gene，1986，45：253-263

［10］Kauri T，Kushner DJ.Role of contat in bacterial degradation of cellulose［J］.Fems Microbiol Ecol，1985，31：301-306

［11］the addition of cellulose binding domains derived from Trichodermareesei［J］.Enzyme and Microbial Technology，2003，32：35-40

［12］LIU Gang，TANG Xing，TIAN Shengli，et al.Improvement of the cellulolytic activity of Trichoderma reesei endoglucanase IV with an additional catalytic domain［J］.World J Microbiol Biotechnol，2006，22：1301-1305

［13］Penttil M，Nevalainen H，Ratto M，et al.A versatile transformation system for the celluloytic filamentous fungus Trichodema reesei［J］. Gene，1987，61（2）：155-164

［14］喬宇，毛愛軍，何永志，等.里氏木霉內切-β-葡聚糖酶Ⅱ基因在畢赤酵母中的表達及酶學性質研究［J］.菌物學報，2004，23（3）：388-396

［15］Himmel ME，Ding SY，Johnson DK，et al.Biomass recalcitrance：engineering plants and enzymes for biofuels production.［J］.Science，2007，315（5813）：804-807

［16］Zhang Jiwei，Zhong Yaohua，Zhao Xuena，et al.Development of the cellulolytic fungus Trichoderma reesei strain with enhanced β-glucosidase and filter paper activity using strong artifical cellobiohydrolase 1 promoter［J］.Bioresource Technology，2010，101（24）：9815-9818

［17］Zhong Yaohua，Liu Xuan，Xiao Peng，et al.Expression and Secretion of the Human Erythropoietin Using an Optimized cbh1Promoter and the Native CBH I Signal Sequence in the Industrial FungusTrichoderma reesei［J］.Biochemistry and Biotechnology，2011，165（5/6）：1169-1177

［18］Wang Bingbing，Xia Liming.High efficient expression of cellobiase gene from Aspergillus niger in the cells of Trichoderma reesei［J］. Bioresource Technology，2011，102（6）：4568-4572

［19］Li Junxin，Wang Juan，Wang Shaowen，et al.Achieving efficient protein expression in Trichoderma reesei by using strong constitutive promoters［J］.Microbial Cell Factories 2012，11：84

［20］Wang Shaowen，Liu Gang，Wang Juan，et al.Enhancing cellulase production in Trichoderma reesei RUT C30 through combined manipulation of activating and repressing Genes［J］.Ind Microbiol Biotechnol，2013，40：633-641

Construction of CBH II and EG IV for Homologous Protein Expression with Constitutive Promoter in Trichoderma Reesei

ZENG Min1，2，Deng Li-yu1，TANG Xin1，LIU Gang1，YU Shao-wen1，*
（1.College of Life Science，Shenzhen Key Laboratory of Microbial Genetic Engineering，Shenzhen University，Shenzhen 518060，Guangdong，China；2.College of Life Science，Shenzhen Key Laboratory of Marine Bioresources and Ecology，Shenzhen 518060，Guangdong，China）

The reconstructed gene cbh2-linker-CDeg4gain two kinds of cellulase catalytic properties，which added the catalytic domain（CD）gene from eg4 to the 3'end of cbh2.The gene cbh2-linker-CDeg4was inserted between T.reesei QM9414 strong promoter PSpdc（including secreting signal peptide sequence）and terminator Tpdc，generating reconstructed plasmid pPIC-PCT.The plasmid pPIC-PCT and plasmid pAN7-1 were transformed into T.reesei via an improved protoplast transformation.SDS-PAGE analysis showed that the fusion protein CBHⅡ-EGⅣhad successfully expressed in T.reesei.The CMCNaactivity of the T.reesei recombinants could reach 4.08 U/mL，which is 5.55-fold as high as that of the host strain；the FPA cativity could reach 0.915 U/mL，which were increased by 43.6%.The cellulase characterization of recombinant showed that the optimum pH value was about 5.0，and the optimum reaction temperature was at 50℃．

gene recombination；cellobiohydrolaseⅡ；endo-β-1，4-glucanaseⅣ；pyruvate decarboxylase promoter

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.13.032

2014-03-12

深圳市基礎研究計劃（JCYJ20120613115323982）

曾敏（1988—），女（漢），碩士研究生，研究方向：酶工程。