心肌組織裂解液誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向心肌樣細(xì)胞分化的研究

楊勇琴，楊開明，熊　偉，趙文珍，周　玥（.大理大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室，云南 大理 67000；.大理大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，云南 大理 67000）

心肌組織裂解液誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向心肌樣細(xì)胞分化的研究

楊勇琴1，楊開明1，熊偉2，趙文珍1，周玥1
（1.大理大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室，云南 大理 671000；2.大理大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，云南 大理 671000）

目的探討心肌組織裂解液定向誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）分化為心肌樣細(xì)胞的可行性。方法 體外分離、培養(yǎng)及鑒定大鼠BMSCs，實(shí)驗(yàn)分為3組：空白對照組、正常心肌組織裂解液誘導(dǎo)組和梗死心肌組織裂解液誘導(dǎo)組。分別對第3代BMSCs進(jìn)行定向誘導(dǎo)，倒置相差顯微鏡觀察誘導(dǎo)后細(xì)胞形態(tài)變化。誘導(dǎo)4周后，Western-blot檢測心肌肌鈣蛋白T（cTnT）、心肌連接蛋白43（Cx43）的表達(dá)。結(jié)果 P3代BMSCs CD34染色呈陰性，而CD 105、CD 106染色呈陽性。兩個(gè)誘導(dǎo)組cTnT、Cx43蛋白表達(dá)量均高于空白對照組，且梗死心肌裂解液誘導(dǎo)組的蛋白表達(dá)量高于正常心肌組織裂解液誘導(dǎo)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論 正常心肌組織裂解液及梗死心肌組織裂解液均可誘導(dǎo)BMSCs分化為心肌樣細(xì)胞，且梗死心肌組織裂解液組誘導(dǎo)分化效率更高。

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；心肌組織裂解液；心肌樣細(xì)胞

冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病是我國心血管患者住院的首要原因，發(fā)病率逐年上升。心肌梗死是冠心病患者的嚴(yán)重表現(xiàn)形式，梗死部位的心肌細(xì)胞被瘢痕組織所替代，導(dǎo)致不同程度的心室重構(gòu)，心梗后患者往往存在不同程度的心臟功能不全，逐漸進(jìn)展演變?yōu)樾牧λソ撸蝗魮尵炔患皶r(shí)甚至可能危及生命，其病理基礎(chǔ)為心肌壞死［1］。成體心肌細(xì)胞屬于終末分化細(xì)胞，不能通過自身的再生對損傷后的心肌細(xì)胞進(jìn)行修復(fù)，細(xì)胞移植是目前治療心肌梗死等心血管疾病的重要手段，治療后患者心功能得以改善。BMSCs具有向神經(jīng)細(xì)胞、脂肪細(xì)胞及心肌細(xì)胞等多種類型細(xì)胞分化的潛能，BMSCs是細(xì)胞移植治療心肌損傷最有前景的種子細(xì)胞之一［2-3］。誘導(dǎo)BMSCs分化為心肌細(xì)胞是干細(xì)胞工程研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)問題。目前誘導(dǎo)分化的主要方法為：①化學(xué)誘導(dǎo)法。采用試劑為5-氮雜胞苷及TGF-β1、BMP-2、Wnt11等細(xì)胞因子；②心肌微環(huán)境誘導(dǎo)法。細(xì)胞共培養(yǎng)法最為常見；相對于化學(xué)誘導(dǎo)法這種方法具有無細(xì)胞毒副作用，且定向誘導(dǎo)特異性較高的特點(diǎn)，更適于臨床應(yīng)用。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用正常心肌裂解液和梗死心肌裂解液對BMSCs做體外誘導(dǎo)，使其定向分化為心肌樣細(xì)胞，并從形態(tài)學(xué)、蛋白表達(dá)的層次觀察并鑒定誘導(dǎo)分化的有效性，探索體外BMSCs誘導(dǎo)分化為心肌樣細(xì)胞的新方法及條件，為細(xì)胞移植治療心肌損傷的臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及主要試劑

健康雄性2月齡SD大鼠，體重（150±13）g（大理大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供），DMEM/F12培養(yǎng)基，胎牛血清（hyclone公司，USA），辣根過氧化物酶標(biāo)記的IgG抗體（GENE公司），兔抗鼠CD34、CD105、CD 106抗體（福州邁新公司），DAB顯色液、BCA蛋白測定試劑盒（福州邁新公司），山羊抗鼠的單克隆一抗cTnT，山羊抗鼠單克隆一抗Cx43（美國Santa Cruz公司），F(xiàn)ITC標(biāo)記的兔抗山羊IgG抗體（武漢博士德）。

1.2 方法

1.2.1 心肌梗死模型制備

雄性SD大鼠，12%烏拉坦1 m l/100g腹腔注射麻醉，左胸第4肋間逐層切開胸腔及心包，于肺動(dòng)脈圓錐與左心耳下緣之間游離并結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支，術(shù)后觀察15 m in，左前壁變蒼白、心肌收縮力減弱、ECG示ST段抬高0.2 mv為造模成功的指標(biāo)，逐層關(guān)閉胸腔，術(shù)后存活大于6 h者作為心肌梗死模型。

1.2.2 心肌組織裂解液制備

脫頸處死大鼠，分別取梗死區(qū)域及周圍正常部位心肌組織，剪碎為1 mm3左右的組織塊，組織均漿機(jī)中破碎10 m in，加入DMEM/F12培養(yǎng)液制備成20 mg/m L的組織均漿液，2500 rpm離心5 m in，吸取上清后用0.22 μm的濾器過濾備用。誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn)中使用的梗死及正常心肌組織裂解液的蛋白濃度均為0.05 mg/m L。

1.3 BMSCs的分離培養(yǎng)及鑒定

0.38%NH4Cl紅細(xì)胞溶解法聯(lián)合貼壁培養(yǎng)法分離培養(yǎng)鼠BMSCs，接種于含DMEM/F12完全培養(yǎng)基的75 cm2培養(yǎng)瓶，37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)后第2天首次半量換液，以后視細(xì)胞生長情況2～3天換液1次，0.25%的胰酶消化傳代，取第3代BMSCs行CD34、CD105、CD106免疫細(xì)胞化學(xué)染色鑒定培養(yǎng)細(xì)胞表面抗原表達(dá)。

1.4 體外誘導(dǎo)BMSCs向心肌樣細(xì)胞轉(zhuǎn)化

取生長良好的P3 BMSCs制成3×105/m L的細(xì)胞懸液，滴加30 μL于25 mm2于6孔板上，置于37℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。4～6 h后待細(xì)胞貼壁，將6孔板內(nèi)細(xì)胞分成3組：①空白對照組，細(xì)胞僅含15%胎牛血清的DMEM/F12完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)。②正常心肌裂解液組：完全培養(yǎng)基中加入正常心肌組織裂解液100 μL；③梗死心肌裂解液組：完全培養(yǎng)基中加入梗死心肌組織裂解液100 μL。

1.5 Western-blot檢測cTnT、Cx43表達(dá)

制備10%聚丙烯酰胺分離膠，三組樣品上樣量均為50 μg，聚丙烯酰胺凝膠電泳，上層膠恒壓80 V，30 min，下層膠恒壓100 V，80 m in，電泳結(jié)束后，恒流250 m A濕轉(zhuǎn)1 h。轉(zhuǎn)膜完畢后，將PVDF膜置于5%脫脂奶粉中封閉1 h，加入1:500的山羊抗鼠的單克隆一抗cTnT，1:1000的山羊抗鼠單克隆一抗Cx43，4℃孵育過夜。PBS洗滌3次，10 m in/次，然后將PVDF膜加入1:300的兔抗山羊IgG，室溫孵育2 h后，PBS洗滌3次，5 m in/次，ECL化學(xué)發(fā)光試劑在化學(xué)發(fā)光儀下顯色。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，使用Quantity one軟件進(jìn)行灰度分析，結(jié)果用目的蛋白與β-actin的比值表示。

2 結(jié) 果

2.1 誘導(dǎo)細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變

加入誘導(dǎo)液的第2天細(xì)胞變短變鈍，第5天大部分細(xì)胞由長梭形變成短桿狀，呈端端相連，緊密連接的“竹節(jié)樣”改變，同時(shí)連續(xù)誘導(dǎo)第10天多個(gè)區(qū)域出現(xiàn)大量多核肌管結(jié)構(gòu)，第12天融合多核肌管均出現(xiàn)自律性搏動(dòng)。

2.2 BMSCs免疫細(xì)胞化學(xué)染色鑒定

P3代細(xì)胞呈現(xiàn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞特征性的形態(tài)和生長方式，并進(jìn)行了CD34、CD105和CD106免疫細(xì)胞化學(xué)染色分析，P3代細(xì)胞的CD34染色均呈陰性反應(yīng)，而CD105、CD106染色陽性細(xì)胞＞98%以上。見圖1、圖2。

圖1 P3骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞CD105染色陽性（×200）

圖2 P3骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞CD106染色陽性（×200）

2.3 Western blot檢測結(jié)果

誘導(dǎo)4周后梗死心肌裂解液組蛋白表達(dá)量高于其他兩組，組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），且正常心肌裂解液組蛋白表達(dá)量高于空白對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖3。

圖3 A：Western-blot檢測骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞cTnT、Cx43表達(dá)（1：梗死心肌裂解液組、2：正常心肌裂解液組、3：空白對照組）；B：蛋白條帶灰度分析

3 討 論

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞表面抗原具有多樣性，表達(dá)CD44、CD105、CD106等多種粘附因子，是鑒別骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的表面抗原，但不表達(dá)CD34、CD45、CD 29等造血干細(xì)胞特有的表面標(biāo)志物。我們通過免疫細(xì)胞化學(xué)染色的方法檢測P3代細(xì)胞CD34、CD105、CD 106的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)CD 34（-）、CD 105（+）、CD 106（+）結(jié)果可初步證明所培養(yǎng)的細(xì)胞為BMSCs。

干細(xì)胞巢是指干細(xì)胞在體內(nèi)所處的微環(huán)境，巢中調(diào)控干細(xì)胞增值及分化的外部信號組成了干細(xì)胞賴以生存的微環(huán)境。干細(xì)胞處于分化還是靜息狀態(tài)、向哪種類型的組織細(xì)胞分化均由干細(xì)胞自身的功能狀態(tài)及其所處的微環(huán)境所決定。微環(huán)境指的是干細(xì)胞周圍的細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)，它與干細(xì)胞的增殖、遷移、分化有著密切的聯(lián)系。有學(xué)者認(rèn)為在不同的微環(huán)境中干細(xì)胞能向不同類型的組織細(xì)胞分化，即“環(huán)境依賴性分化”的特性［4］。微環(huán)境中各種細(xì)胞因子對干細(xì)胞向何種細(xì)胞分化有著決定性作用。我們的實(shí)驗(yàn)在體外培養(yǎng)的條件下加入正常心肌裂解液及梗死心肌組織裂解液，從而改變干細(xì)胞所處的微環(huán)境，對所培養(yǎng)的BMSCs進(jìn)行誘導(dǎo)，結(jié)果證明誘導(dǎo)后的細(xì)胞能出現(xiàn)心肌樣細(xì)胞的形態(tài)改變。目前對體外微環(huán)境誘導(dǎo)BMSCs向心肌樣細(xì)胞分化的具體機(jī)制并不明確。Filipczyk等［5］認(rèn)為其機(jī)制可能有分泌性細(xì)胞因子及蛋白的調(diào)節(jié)作用、細(xì)胞外BMSCs的調(diào)控作用、細(xì)胞間直接作用參與干細(xì)胞生長分化的調(diào)控等。

心肌肌鈣蛋白是心肌源性特異性標(biāo)志物，由cTnI、cTnC、cTnT三個(gè)亞單位組成，在心肌的舒縮活動(dòng)中起重要作用。其中以cTnT亞單位的特異性最高，連接蛋白43（Cx43）是心肌細(xì)胞閏盤縫隙連接的主要結(jié)構(gòu)蛋白，本實(shí)驗(yàn)通過Western blot檢測在兩個(gè)誘導(dǎo)組細(xì)胞內(nèi)均發(fā)現(xiàn)cTnT（+）表達(dá)、Cx43（+）表達(dá)，結(jié)果表明心肌組織裂解液可誘導(dǎo)BMSCs向心肌樣細(xì)胞分化，同時(shí)誘導(dǎo)后的細(xì)胞具備閏盤的結(jié)構(gòu)，能夠進(jìn)行同步收縮。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)證明了正常心肌組織裂解液及梗死心肌組織裂解液體外誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向心肌樣細(xì)胞分化的可行性，且梗死心肌裂解液的誘導(dǎo)分化效率更高，結(jié)果將為下一步的臨床種子細(xì)胞的選擇打下了基礎(chǔ)。

［1］ 黃 呂，張 輝，解 力，等.H9C2細(xì)胞培養(yǎng)液誘導(dǎo)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向心肌樣細(xì)胞分化［J］.中國組織工程研究，2014，19（18）:2981-2986.

［2］ 李 琴，趙文婧，寇亞麗，等.心肌組織裂解液誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向心肌樣細(xì)胞分化［J］.中國組織工程與臨床康復(fù)，2011，15（10）:1726-1730.

［3］ 呂 洋，王海萍，劉 博，等.轉(zhuǎn)化生長因子β1誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為心肌樣細(xì)胞的作用［J］.解剖學(xué)報(bào)，2013，44（1）:49-54.

［4］ 馬新喆，張娟娟，呂 洋，等.骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為心肌樣細(xì)胞的鑒定指標(biāo)［J］.醫(yī)學(xué)綜述，2014，20（7）: 1164-1166.

［5］ Filpiczyk AA，Passier R，Rochat A，et al.Regulation of cardiomyocyte differientiation of embryonic stem cells by extracellular signalling.Cell Mol Life Sci，2007，64（6）:704-718.

本文編輯：吳 衛(wèi)

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ISSN.2095-6681.2015.27.179.02

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