豁痰解毒通絡(luò)飲對(duì)AngII誘導(dǎo)大鼠心肌細(xì)胞增殖IL-1β、TNF-α mRNA的影響

沈娟娟，鄧　悅，張兆志（長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，吉林 長(zhǎng)春 130117）

豁痰解毒通絡(luò)飲對(duì)AngII誘導(dǎo)大鼠心肌細(xì)胞增殖IL-1β、TNF-α mRNA的影響

沈娟娟，鄧悅，張兆志
（長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，吉林 長(zhǎng)春 130117）

目的研究豁痰解毒通絡(luò)飲對(duì)大鼠心肌細(xì)胞增殖及IL-1β、TNF-α mRNA的影響。方法 采用血清藥理學(xué)方法，體外培養(yǎng)大鼠心肌細(xì)胞系，分為正常組、模型組、豁痰解毒通絡(luò)方組、纈沙坦組、吡格列酮組。MTT法檢測(cè)大鼠心肌細(xì)胞增殖情況。RT-PCR法檢測(cè)白介素-1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）mRNA的表達(dá)。結(jié)果 血管緊張素II（Ang II）作用細(xì)胞12 h后，與空白組比較，IL-1β、TNF-α mRNA表達(dá)極顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與模型組比較，豁痰解毒通絡(luò)飲干預(yù)后，IL-1β、TNF-α mRNA表達(dá)極顯著下調(diào)（P＜0.05）。結(jié)論 豁痰解毒通絡(luò)飲能夠抑制Ang II誘導(dǎo)大鼠心肌細(xì)胞增殖，下調(diào)IL-1β、TNF-α mRNA的表達(dá)。

豁痰解毒通絡(luò)飲；心肌重構(gòu)；心肌細(xì)胞肥大；大鼠

近年來(lái)左心室肌肥厚與炎癥機(jī)制的關(guān)系備受關(guān)注。炎癥因子在體內(nèi)釋放后相互作用，通過(guò)免疫調(diào)控網(wǎng)絡(luò)參與左心室肌肥厚的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程［1］。炎癥應(yīng)答是高血壓病靶器官損傷的重要致病因素［2］。運(yùn)用中醫(yī)學(xué)組方治療心肌肥厚的報(bào)道較少。本論文將AngII誘導(dǎo)大鼠心肌細(xì)胞增殖所致炎癥狀態(tài)與中醫(yī)“痰、瘀、毒”理論結(jié)合起來(lái)，用豁痰解毒通絡(luò)飲含藥血清對(duì)Ang II誘導(dǎo)大鼠心肌細(xì)胞增殖及IL-1β、TNF-α mRNA的表達(dá)影響，探討其作用的可能性機(jī)制，為臨床的應(yīng)用治療提供客觀理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)W istar雄性大鼠50只，30日齡，體質(zhì)量（280±20）g，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK（吉（2003-0001，由吉林大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。大鼠普通飼料。大鼠心肌細(xì)胞系H9c2（2-1）（購(gòu)自上海中科院）。

1.2 藥品與試劑

中藥：豁痰解毒通絡(luò)飲：甘松、丹參、當(dāng)歸等藥物組成。生藥由長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院制劑中心提供，由中藥房代煎濃縮而成，含生藥量為2.33 g/m l，4℃冰箱保存。

Ang II（Sigma公司，MA 02139-1517）、纈沙坦（北京諾華制藥有限公司，批號(hào)H 20040217，規(guī)格80 m g）、DM EM培養(yǎng)基（Hy c lone公司，SH 30022.01B）、胰蛋白酶（H y c lone公司，SV 30031.01）、胎牛血清（H y c lone公司，SV 30087.02），RT-PCR試劑盒（TaKaRa公司，e98237），PCR引物由上海生工有限公司合成。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

電泳儀（北京六一儀器廠，DYY-2D）；基因擴(kuò)增儀（Ferrotec公司，TC-96/G/H（b（A）；離心機(jī)（凱特實(shí)驗(yàn)儀器有限公司，TG12M）；AIR TECH凈化工作臺(tái)（蘇凈集團(tuán)安泰公司，HWDCB-1340）。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 含藥血清制備

50只W istar大鼠適宜性喂養(yǎng)一周后，將其隨機(jī)分為5組，依次為空白組、模型組、豁痰解毒通絡(luò)組、纈沙坦組、吡格列酮組。空白組和模型組灌胃等體積蒸餾水?；硖到舛就ńj(luò)組的灌胃劑量為16.3 mg/kg，纈沙坦組灌胃劑量為30 mg/kg，吡格列酮組灌胃劑量為50 mg/kg，相當(dāng)于人臨床用量7倍。動(dòng)物給藥體積為10 m l/kg。連續(xù)用藥7天，1次/d，于末次給藥后2 h，腹主動(dòng)脈取血分離血清［3］。56℃水浴滅活30 m in，微孔濾膜滅活濾菌，-80℃冷藏備用。

1.4.2 心肌細(xì)胞培養(yǎng)及分組給藥

H 9c2細(xì)胞培養(yǎng)于含10%小牛血清的高糖DM EM培養(yǎng)基中，經(jīng)0.25%胰蛋白酶消化分離，于平皿培養(yǎng)板中傳代接種。隨機(jī)分為5組，分別為空白組（不加藥物和AngⅡ刺激）、模型組（AngⅡ 10～7 mol/L刺激）、豁痰解毒通絡(luò)組、纈沙坦組、吡格列酮組（不同組別含藥血清預(yù)先培養(yǎng)2 h后，AngⅡ 10～7 mol/L刺激12 h）［4］。

1.4.3 含藥血清的毒理學(xué)評(píng)價(jià)

應(yīng)用M TT比色法進(jìn)行分析。96孔培養(yǎng)板培養(yǎng)H9c2細(xì)胞，細(xì)胞濃度為4×105個(gè)，37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)18 h后，每孔加入不同質(zhì)量濃度的含藥血清培養(yǎng)2 h，加Ang II 10-7mol/L刺激細(xì)胞18 h，后每孔加入MTT溶液（5 mg/m L）20 μL，37℃培養(yǎng)4 h后棄上清液，每孔加入二甲基亞砜（Dimethyl sulfoxide，DMSO）150 μL，振蕩10 m in，選擇490 nm波長(zhǎng)，在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上測(cè)定各孔光吸收值（OD值）。

1.4.4 RT-PCR測(cè)定原癌基因IL-1β、TNF-α mRNA的表達(dá)

提取細(xì)胞總RNA。采用RNA試劑盒提取總RNA，將RNA加入Rnase ddH 2O中。根據(jù)紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA濃度和純度。重復(fù)3次，計(jì)算樣品總RNA濃度OD260：OD 280比值在1.8～2.0。逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)：按照反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（reverse transcription Polym erase Chain Reaction，RT-PCR）試劑盒（TAKARA）的說(shuō)明。進(jìn)行目的基因擴(kuò)增。TNF-α引物（Forward Primer：5'-GGTCCCAACAAGGAGGAGA-3'，Reverse Primer：5'-TGGTATGAAATGGCAAATCG-3'，特異性擴(kuò)增片段為329bp）；IL-1β引物（Forw ard Primer：5'-CTCATTGTGGCTGTGGAGAA-3'，Reverse Primer：5'-GGGATTTTGTCGTTGCTTGT-3'，特異性擴(kuò)增片段為323bp）；β-actin引物（Forw ard Prim er：5'-GCCGTCTTCCCCTCCATCGTG-3'，Reverse Primer：5'-TAC GACCAGAGGCATACAGGGACAAC-3'，特異性擴(kuò)增片段為357bp）。PCR條件為：94℃預(yù)變性5 m in；94℃變性30 s；72℃延伸45 s；72℃最后延伸7 m in；共30個(gè)循環(huán)。TNF-α、IL-1β、β-actin m RNA退火溫度依次為54.8℃、58.2℃、60℃。PCR產(chǎn)物的檢測(cè)和分析：PCR產(chǎn)物5 μL，2%瓊脂糖凝膠電泳30 min（80 V），以β-actin PCR反應(yīng)產(chǎn)物為內(nèi)參，進(jìn)行電泳檢測(cè)，用AlphaImager EP凝膠成像儀分析系統(tǒng)進(jìn)行拍照和灰度分析。mRNA相對(duì)表達(dá)水平以積分光度比值：（目的基因條帶強(qiáng)度×面積）/（參照基因條帶強(qiáng)度×面積）表示。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 13.0軟件統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，數(shù)據(jù)以“±s”表示，采用ONEWAY-ANVONA方法分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 含藥血清的毒理學(xué)評(píng)價(jià)

豁痰解毒通絡(luò)飲、纈沙坦、吡格列酮組含藥血清組15%濃度作用細(xì)胞后，較模型組及空白組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。說(shuō)明豁痰解毒通絡(luò)飲有抑制大鼠心肌細(xì)胞H9c2增殖的作用，其抑制作用以10%倍劑量最佳。見(jiàn)圖1。

2.2 含藥血清對(duì)AngII誘導(dǎo)心肌細(xì)胞IL-1β、TNF-αmRNA的影響

圖1 MTT檢測(cè)結(jié)果

模型組較空白組比較，IL-1β、TNF-α mRNA的表達(dá)極顯著增強(qiáng)（P＜0.05），豁痰解毒通絡(luò)組、纈沙坦組及吡格列酮組較模型組比較，IL-1β、TNF-α mRNA表達(dá)極顯著下調(diào)（P＜0.05）。見(jiàn)圖2。

圖2 RT-PCR檢測(cè)IL-1β、TNF-α mRNA的表達(dá)

3 討 論

高血壓病的主要靶器官損害見(jiàn)于左心室肥厚，左心室肥厚是心血管疾病主要危險(xiǎn)因素，是現(xiàn)代心血管疾病中亟待解決的問(wèn)題［5］。腫瘤壞死因子TNF-α、IL-1β既是其活化信號(hào)通路的上游因素，又是活化信號(hào)通路的產(chǎn)物，兩者即相互作用，在高血壓病左室肥厚病程演變過(guò)程中發(fā)揮主要的作用［6］。

本研究通過(guò)觀察豁痰解毒通絡(luò)飲抑制AngⅡ誘導(dǎo)H9c2細(xì)胞增殖的影響，發(fā)現(xiàn)豁痰解毒通絡(luò)飲能夠極顯著降低IL-1β、TNF-α mRNA的表達(dá)。說(shuō)明豁痰解毒通絡(luò)飲具有抑制大鼠心肌細(xì)胞增殖的作用，并能下調(diào)IL-1β、TNF-α mRNA的表達(dá)。為臨床的應(yīng)用治療提供客觀理論依據(jù)。

［1］ 張群豪.用藥物血清學(xué)方法觀察血俯逐瘀濃縮丸對(duì)實(shí)驗(yàn)性動(dòng)脈粥樣硬化家兔主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖的影響.中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合雜志，2006，16（3）:156.

［2］ 邱幸生.益氣通絡(luò)方對(duì)缺氧再給氧心肌細(xì)胞bc l-2基因表達(dá)影響的血清藥理學(xué)研究.中國(guó)中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志，2011，7（3）:38-40.

［3］ 米永杰，李 健.中藥血清藥理學(xué)研究概述.四川解剖學(xué)雜志，2006，14（4）:35

［4］ 吳健宇，李儀奎，符勝光.補(bǔ)陽(yáng)還五湯保護(hù)自由基損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞的血清藥理實(shí)驗(yàn)方法的建立.中藥藥理與臨床，2009，15（1）:45

［5］ 韓學(xué)杰，丁 毅，王麗穎，等.高血壓病痰瘀互結(jié)與炎癥因子相關(guān)的機(jī)制探討［J］.中華中醫(yī)藥雜志，2010，5:362.

［6］ Cai D，F(xiàn)rantz JD，Tawa NE Jr，et al.IKKβ/NF-κB activation causes severe muscle wasting in mice，Cell，2004，119:285.

本文編輯：吳玲麗

The effect of huo tan jie du tong luo drink on the expression of AngII-induced cardiom yocyte proliferation in rats IL-1β，TNF-α m RNA

SHEN Juan-juan，DENG Yue，ZHANG Zhao-zhi
（The A ffiliated Hospital of Changchun University of Chinese Medicine，Jilin Changchun 130117，China）

Ob jective To study the effect of the huo tan jie du tong luo drink on cardiac m yocyte proliferation and the expression of IL-1β、TNF-α mRNA.M ethods Serum pharmacology，cultured rat myocardial cells， divided into normal control group，model group，huo tan jie du tong luo drink group，valsartan group，pioglitazone group.And myocardial cell proliferation was measured by MTT assay.The expression of IL-1β，TNF-α mRNA was measured by RT-PCR assay.Results AngII infected cells for 12h， compared w ith the normal group，the expression of IL-1β，TNF-α mRNA was significantly increased（P＜0.05）.Compared w ith the model group，huo tan jie du tong luo drink intervention，the expression of IL-1β，TNF-α mRNA decrease（P＜0.05）. Conclusion Huo tan jie du tong luo drink induced angII-induced cardiomyocyte proliferation in rats and decrease the expression of IL-1β，TNF-α mRNA.

Huotanjiedutongluo drink；Myocardial remodeling；Cardiac myocyte hypertrophy；Rats

R289.5

B

ISSN.2095-6681.2015.27.183.03

吉林省衛(wèi)生廳科研課題（課題編號(hào)20132040）