固相反硝化系統中微生物群落結構的研究進展

張蘭河左正艷，王旭明

（1.東北電力大學化學工程學院，吉林132012；2.北京市農林科學院北京農業生物技術研究中心，北京 100097）

固相反硝化系統中微生物群落結構的研究進展

張蘭河1左正艷1，2王旭明2

（1.東北電力大學化學工程學院，吉林132012；2.北京市農林科學院北京農業生物技術研究中心，北京 100097）

固相反硝化是一種新型的異養反硝化工藝，采用固體有機物同時作為反硝化微生物的碳源和生物膜載體，可用于地下水和低C/N比污水的脫氮處理。固相反硝化系統生物膜的微生物群落結構決定固體碳源的降解效率，進而決定反硝化脫氮的速率和系統的穩定運行。因此，微生物群落結構的研究對于固相反硝化工藝的優化以及反應機理的解析具有重要意義。對不同固相反硝化系統微生物群落結構的研究現狀和進展進行了綜述，并探討了當前研究中存在的問題和發展趨勢。

固相反硝化；硝酸鹽；生物膜；微生物群落

DIO： 10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.01.006

生物反硝化是自然界氮素循環的關鍵步驟之一，并在水源水［1，2］及污水［3，4］的脫氮處理中得到了廣泛應用。生物反硝化主要由異養微生物利用硝酸鹽作為電子受體，使之逐步還原為氮氣的生物學過程。在污水脫氮處理過程中，有機物是異養微生物進行新陳代謝的必要物質和能量來源，因此，碳源是決定反硝化進程及系統脫氮能力與效率的關鍵因素［5］。對于地下水和低C/N比污水的生物脫氮來說，需要外加碳源作為電子供體才能保證反硝化的順利進行。我國大部分污水廠都存在碳源不足的問題［6］，因此，適宜碳源的選擇對于污水的生物脫氮具有重要的現實意義。

常規反硝化工藝通常加入甲醇、乙醇和乙酸等可溶性有機物作為補充碳源［7］。雖然可溶性碳源具有反硝化速率高，成本低的優點，但存在碳源容易過量影響出水水質的風險，尤其在進水硝酸鹽有波動的情況下，碳源投加量的調控更加困難［8］。為克服上述弊端，人們嘗試采用非水溶性固體有機物同時作為反硝化微生物的碳源和生物膜載體，實現污染水體的反硝化脫氮，這種工藝稱為“固相反硝化（Solid-phase denitrification）”［9］。該工藝無需復雜的碳源投加控制系統，操作簡單，運行穩定［10］。目前，固相反硝化工藝已成功應用于地下水［11，12］、低C/N比污水［13］及水產養殖系統［14，15］中硝酸鹽的去除。

在固相反硝化工藝中，微生物在碳源表面的定植并形成穩定的生物膜是決定反硝化的限速步驟［1］，而且生物膜中的微生物組成決定固體碳源的分解及反硝化脫氮的效率。因此，全面了解固相反硝化系統的微生物群落結構與功能菌群，對于優化反應器的設計，改善系統脫氮性能，揭示反應機理都具有重要意義［16］。本文針對不同固體碳源反硝化系統的微生物群落結構研究進展進行綜述，并展望未來的研究趨勢。

1 不同固體碳源反硝化系統的微生物群落結構

1.1 PHAs反硝化系統

聚羥基脂肪酸酯（Polyhydroxyalkanoates，PHAs）是微生物自身合成的一種細胞內聚酯，是一種天然的高分子材料。PHAs家族中的聚羥基丁酸（Polyβ-hydroxybutyrate，PHB）和聚羥基丁酸戊酸共聚酯［poly（3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate），PHBV］ 因具有良好的生物相容性、生物可降解性和塑料的熱加工性能，成為近年來生物材料領域最為活躍的研究熱點。PHBV在20世紀80年代就已經實現了商品化生產（商品名為Biopol）［17］。在水污染控制領域，PHB和PHBV可用作固體碳源去除地下水［11］、循環水產養殖系統［18］中的硝酸鹽。隨著PHBV生產規模及其應用范圍的不斷擴大，價格也逐漸降低，這為PHBV在水體脫氮領域的大規模應用提供了可能［18］。

最早利用PHB和PHBV進行反硝化脫氮的是德國斯圖加特大學的Müller等［19］，他們報道了一種填充PHBV顆粒的升流式固定床反應器，這種反應器表現出較高的反硝化速率，但當時并沒有對反應器微生物的群落結構進行分析。Mergaert等［20］首先采用傳統的純培養方法，從PHBV反硝化系統中分離到186株異養細菌，分別屬于Acidovorax、Pseudomonas、Agrobacterium、Alcaligenes、Afipia、Phyllobacterium、Stenotrophomonas和 Brevundimonas等。其中Brevundimonas屬的菌株所占比例最高（30.6%）；其次為Pseudomonas（18.8%）和Acidovorax（6.5%）。研究還發現，反應器頂部和底部的微生物在分類地位和潛在功能上具有顯著差異。例如，分離到的35株Pseudomonas有34株存在于反應器的下部，而所有Acidovorax facilis（12株）和Alcaligenes spp.（7株）都只存在于反應器上部。隨后，Khan等［21］從PHBV為碳源的反應器中分離鑒定了50株占優勢的異養反硝化細菌，包括Brevundimonas、Paracoccus、Acidovorax、Aquitalea、Brachymonas、Castellaniella、Comamonas、Diaphorobacter、Simplicispira、Klebsiella和Pseudomonas共11個屬。以上分離菌株均屬于變形菌門（Proteobacteria），其中90%屬于β-變形菌綱（Betaproteobacteria），尤其是叢毛單胞菌科（Comamonadaceae）為反應器的主要反硝化類群（占70%）。以上所有分離菌株都能利用乙酸鹽和3-羥基丁酸作為碳源進行反硝化，但只有2個屬（Comamonas和Diaphorobacter）的菌株能利用PHBV作為碳源進行反硝化。平板計數的結果表明，反應器中可培養的異養細菌（108左右）有83%具有反硝化能力，而能夠降解PHBV的反硝化細菌（106-107）只占反硝化細菌總數的4.5%左右。以上研究結果表明，PHBV反應器中的反硝化細菌大多不能降解PHBV，但是能利用PHBV的降解產物乙酸鹽和3-羥基丁酸作為碳源進行反硝化。因此，利用具有PHBV降解能力的高效反硝化菌株作為接種物，將會提高系統的脫氮效率，有助于實現PHBV在污水反硝化脫氮領域的工程應用。自然界中具有PHBV降解或反硝化功能的微生物類群很多，但同時具備上述兩種功能的微生物并不多見。表1列出了目前已知能降解PHBV的反硝化細菌，其中Diaphorobacter nitroreducens NA10B是反硝化效率最高的PHBV降解菌，該菌株以PHBV為唯一碳源的反硝化速率為19 mg N/（g·h）［26］。

近年來，分子生態學技術開始被用于固相反硝化系統微生物群落結構的分析。徐影等［27］采用PCR-DGGE技術分析了PLA/PHBV（聚乳酸/聚羥基丁酸戊酸共聚酯）填充床反硝化反應器微生物群落結構的動態變化。在反應器的運行初期，固體碳源PLA/PHBV顆粒表面生物膜中的微生物多樣性下降明顯，但功能微生物的相對豐度增加。當反應器穩定運行時，DGGE圖譜中特征條帶的香農威爾指數和辛普森指數均變化不大，微生物群落結構保持相對穩定，這是反應器能夠穩定運行的直接原因。反應器穩定運行時，Diaphorobacter為生物膜中最優勢菌群。此外，生物膜還包括Acidovorax、Rubrivivax、Azospira、Thermomonas、Devosia幾個屬的菌株，以上菌株均屬于變形菌門（Proteobacteria）都可以進行反硝化，但只有Diaphorobcter和Acidovorax兩個屬的菌可以通過自身合成的PHBV解聚酶降解PHBV［28］。張蘭河等［25］在常規循環水養殖系統中加入一個以PHBV為碳源的反硝化單元，能有效控制養殖系統的硝酸鹽濃度。反應器生物膜細菌歸屬于變形菌門（包括Betaproteobacteria、Gammaproteobacteria和Deltaproteobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）和擬桿菌門（Bacteroidetes）。反應器運行初期（40 d）的優勢種群主要為Acidovorax和Bacillus；運行后期（150 d）的優勢種群依次為 Clostridium、Desulfitobacterium、Dechloromonas、Pseudoxanthomonas和Flavobacterium。雖然，該研究發現PHBV反應器的微生物組成比其他的PHBV反應器復雜，但并未發現其他PHBV反硝化系統常見的優勢菌群Diaphorobacter，這可能與反應器進水的水質不同有關。

表1 降解PHBV的反硝化細菌

綜上所述，PHBV反硝化系統中，變形菌門的β-變形菌綱（Betaproteobacteria）是主要的微生物類群，尤其是以活性污泥作為接種物的反應器［20，21，26，27］。在反應器運行的不同階段，微生物的群落結構存在一定差異，但隨著反應器的連續運行，微生物群落結構逐漸達到穩定，其中大多數微生物可以利用PHBV的降解產物乙酸鹽和3-羥基丁酸作為碳源進行反硝化。Diaphorobacter nitroreducens NA10B是從PHBV系統分離到的反硝化速率最高的PHBV降解菌［26］。

1.2 PCL反硝化系統

聚己內酯（Polycaprolactone，PCL）是一種人工合成的聚合物，因具有優越的可生物降解性、生物相容性和力學性能而得到了廣泛關注，并獲得美國FDA的批準。1993年由美國Union Carbide公司實現商業化生產，商品名為TONE。與PHAs相似，PCL也可作為固體碳源用于低有機污染水的脫氮處理［29］。最早利用PCL進行反硝化研究的是德國斯圖加特大學的Boley等［8］，該團隊利用PCL作為碳源，有效去除了循環水產養殖系統中過量的硝酸鹽，為循環水產養殖系統的硝酸鹽控制提供了一種簡單方法。

最早對PCL反硝化系統微生物組成進行研究的也是Boley等［30］，他們利用PCL作為碳源去除飲用水中的硝酸鹽和農藥硫丹，并從反應器中分離出246株細菌，通過脂肪酸分析將這些細菌大致分為5個 屬：Acidovorax、Pseudomonas、Brevundimonas、Kocuria和Micrococcus。其中Acidovorax為反應器的優勢種群，Acidovorax facilis占分離菌株總數的78%。從以上結果可以看出，PCL反硝化系統與PHBV反硝化系統的主要微生物組成相近，這可能是因為二者均為聚酯類，其水解均受酯酶催化的緣故。除了以上主要細菌類群之外，還存在22株脂肪酸特征相近的細菌無法確定分類地位。Mergaert等［31］根據這22株細菌的生理生化特征和DNA的G+C含量，以及DNA雜交的結果，提出以上菌株屬于Thermomonas屬的2個新種：T. fusca和T. brevis。

自2005年以來，以Roche公司的454技術、Illumina公司的Solexa技術和ABI公司的SOLiD技術為標志的高通量測序技術（第二代測序技術）相繼誕生［32］，并很快在環境微生物群落的研究中得到了應用［33］。Chu等［12］利用454焦磷酸測序技術分析了PCL反硝化系統的微生物多樣性，其中變形菌門豐度最高，占80%以上，此外還存在綠菌門（Chlorobi）（5.2%）、擬桿菌門（2.3%）、厚壁菌門（0.7%）、螺旋體門（Spirochaetes）（0.3%）、綠彎菌門（Chloroflexi）（0.3%）和酸桿菌門（Acidobacteria）（0.2%）。從屬的水平來看，PCL反硝化系統中Diaphorobacter的相對豐度最高（19.45%）， 其 次 是Hydrogenophaga（3.94%）、Rhodocyclaceae uncultured（1.37%）、Desu-lfovibrio（1.09%）等。Wu等［34］的研究也得到了相似的結果，但在屬的水平上存在差異，他們發現PCL反硝化系統中相對豐度最高的是Alicycliphilus（8.36%），其次為Diaphorobacter（4.59%）。這可能與反應器接種污泥的來源與菌群組成不同有關。以上關于PCL反硝化系統高通量測序的結果都表明變形菌門中的β-變形菌綱豐度最高，但Horiba等［35］利用熒光原位雜交（FISH）技術發現PCL反硝化系統中α-變性菌綱的豐度最高，其次為β-變形菌綱。這可能與采用的分子生態學研究手段不同有關［35］。

與其他的可生物降解聚合物相比，淀粉是一種豐富的可再生的多聚糖，并且具較高的生物可降解性能和低廉的價格，而PCL又具有熱穩定性和空間穩定性。Shen等［36］將二者交聯形成S-PCL（Starch-polycaprolactone）作為碳源進行反硝化脫氮，利用454焦磷酸測序技術發現生物膜微生物主要包括6大類：變形菌門、擬桿菌門、綠彎菌門、厚壁菌門、螺旋體門和放線菌門（Actinobacteria）。變形菌門豐度最高可占到85.05%，其中β-變形菌綱占變形菌門的82.39%，表明β-變形菌綱是生物膜中的優勢種群。從屬的水平來看，S-PCL生物膜中微生物包括58個屬，但有53.42%的序列不能歸入已知的屬。可鑒定相對豐度最高的15個屬（占可鑒定屬的93.79%）依次為：Diaphorobacter、Acidovorax、Dechloromonas、Alicycliphilus、Roseiflexus、Prevotellaceae uncultured、Treponema、Cloacibacterium、Pectinatus、Stenotrophomonas、Cellulomonas、Desulfovibrio、Azospira、Flavobacterium和Anaeroarcus。其中Diaphorobacter和Acidovorax共占可鑒定屬總數的52.75%。S-PCL系統與PCL反硝化系統的高通量測序結果略有不同［12，34，36］，這可能與S-PCL碳源中含有易降解的淀粉有關。

1.3 PBS反硝化系統

聚丁二酸丁二醇酯［poly（Butylene succinate），PBS］是一種性能優良的脂肪酸聚酯，干燥環境中穩定，在泥土、海水及堆肥中能完全降解，因此可在較長的貯存和使用期內保持性能穩定，而使用后降解產物無毒。董明來等［37］利用PCR-DGGE技術研究了PBS作為碳源時反應器微生物組成的動態變化。結果表明，PBS生物膜中微生物的多樣性逐漸增加，當反應器對硝酸鹽的去除效果達到穩定時，生物膜的微生物群落組成也達到穩定。PBS生物膜中微生物所占比例分別是：變形菌門93.75%，厚壁菌門6.25%，其中變形菌門中β-變形菌綱占到60%、λ-變形菌綱33.4%、α-變形菌綱6.6%。β-變形菌綱中叢毛單胞菌科（Comamonadaceae）和紅環菌科（Rhodocyclaceae）是主要的功能菌群。

Wu等［38］采用454測序技術研究了PBS反硝化系統的微生物群落結構發現，3大類菌群占整個微生物群落的96.09%，包括變形菌門（88.35%）、擬桿菌門（3.23%）和綠彎菌門（4.51%）。PBS生物膜中可鑒定到屬水平的微生物只占總數量的20%左右，其中反硝化細菌的比例達到13.02%，主要包括Diaphorobacter、Acidovorax、Dechloromonas、Alicycliphilus、Desulfovibrio、Azospira、Thauera、Simplicispira和Hydrogenophaga。

1.4 其他固體碳源反硝化系統

有很多研究者以農林廢棄物，如植物秸稈、玉米芯、棉花等作為固體碳源進行反硝化脫氮。Wang等［39］利用玉米芯作為碳源同時去除地下水中的硝酸鹽和5-氯酚，證實了5-氯酚在反硝化條件下的生物降解作用。該研究者還利用可降解餐盒作為碳源同時去除硝酸鹽與4-氯酚［40］，實現了硝酸鹽與4-氯酚的同時去除。但是以上研究都沒有進一步研究反硝化系統的微生物組成。王小嬌等［41］利用玉米芯作為碳源，結果發現以玉米芯為載體的生物膜優勢菌群變化規律與生存環境的變化密切相關：當水體溶解氧水平較低時，生物膜上的優勢種群以兼氧/厭氧的梭狀芽孢桿菌（Clostridium）等反硝化異養菌為主；當水體中溶解氧提高后，生物膜上的優勢種群以好氧/兼氧的異養桿狀細菌——芽孢桿菌屬（Bacillus）為主，而且這些菌體內均含有硝酸鹽還原酶。

范振興等［42］研究了聚乳酸（Polylactic acid，PLA）顆粒作為反硝化碳源的可行性。研究發現PLA作為碳源需要較長的馴化時間（40 d），這是因為相比PHBV和PCL，PLA更難生物降解［42］。利用掃描電鏡觀察到PLA顆粒表面生物膜以球菌為主，但該研究沒有對生物膜的微生物進行鑒定。

Masaaki等［43］探討了PLA分子量對反硝化脫氮的影響。使用重均分子量（Mw）為9 900 g/mol的PLA，其反硝化速率（3.5-5.3 mg N/g·h）遠高于分子量為12 000和45 100 g/mol的PLA（0.03-0.45 mg N/g·h）。通過PCR-DGGE技術和16S rRNA基因克隆文庫對PLA系統微生物的群落結構進行了分析，主要菌群及其相對豐度為：變形菌門50%，擬桿菌門28.3%，厚壁菌門13.7%，浮霉菌門5.6%，綠彎菌門1.6%，疣微菌門0.8%。變形菌門是系統中的優勢類群，尤其是β-變形菌綱豐度最高，其中的叢毛單胞菌科（Comamonadaceae）是主要的反硝化細菌并且可以利用PLA的水解產物。該研究沒有從反應器中分離到能降解PLA的微生物，研究者認為可能是非生物因素使PLA水解為乳酸鹽，然后反應器中的微生物以PLA的降解產物為碳源進行反硝化。此外，也可能是反應器中PLA降解菌的豐度太低，純培養的方法難以有效分離。盡管PLA反硝化系統的優勢微生物類群與PHBV反硝化系統相同，均為變形菌門，但其微生物群落組成要比PHBV系統的復雜，如浮霉菌門和疣微菌門并沒有在PHBV為碳源的反硝化系統中發現。

2 小結

固相反硝化系統的微生物群落結構決定固體碳源的降解和反硝化速率。因此，關于系統中微生物群落結構與功能的解析是固相反硝化工藝的核心問題。盡管PCR-DGGE、454焦磷酸測序等現代分子生態學技術已經成功應用于固相反硝化系統微生物組成的分析，但現有研究只針對于nir，nor等反硝化基因［21］或部分16S rRNA基因序列［27，34］的分析，難以全面準確地揭示生物膜微生物群落結構及功能的深度信息［44］，尤其是缺少微生物在種水平上的詳細信息［45］。通過對生物膜總DNA進行宏基因組學分析，可為上述問題提供有效的解決方案［46］。

此外，現有研究只針對固相反硝化系統中的細菌，至于固相反硝化系統中是否存在真菌和古菌，以及真菌和古菌的群落結構還缺少相關研究。Shen等［36］的研究盡管發現在固相反硝化系統中存在真核微生物，但沒有確定這些真核微生物的分類地位。通過真菌和古菌的特異引物對生物膜樣品進行基因擴增和測序，可望揭示固相反硝化系統中真菌和古菌的組成，從而為全面解析固相反硝化系統的微生物群落結構，及其與碳源降解和反硝化功能之間的關系奠定基礎。

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（責任編輯 狄艷紅）

Research Progress on Microbial Community Structure in Solid-phase Denitrification Systems

Zhang Lanhe1Zuo Zhengyan1，2Wang Xuming2
（1. School of Chemical Engineering，Northeast Dianli University，Jilin 132012；2. Beijing Agro-Biotechnology Research Center，Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences，Beijing 100097）

Solid-phase denitrification（SPD）is a new type of heterotrophic denitrifying process， in which solid organic matters are used simultaneously as carbon source and biofilm support. SPD process has been applied on nitrogen removal from groundwater and wastewater with the low ratio of carbon to nitrogen. Microbial community structure in SPD system determines not only degradation efficiency of solid carbon source but also denitrification rate and stable running of the SPD system. Therefore， the research on microbial community structure is significant for the optimizing SPD process and exploring its mechanism. This review summarized the present research status and progress on microbial community structure in different SPD systems. In addition， the main problems and the new perspectives in the present study were also discussed.

solid-phase denitrification；nitrate；biofilm；microbial community

2014-04-23

國家自然科學基金項目（21077014），北京市科技計劃課題（Z121100001512008），北京市農林科學院科技創新能力建設專項（KJCX20140420，KJCX201204006），吉林省科技發展計劃項目（20150519020JH）

張蘭河，男，博士，研究方向：水污染控制技術；E-mail：zhanglanhe@163.com

王旭明，男，博士，副研究員，研究方向：環境生物技術；E-mail：wangxuming@baafs.net.cn