鵪鶉腸道微生物PCR-DGGE方法的優化

張振華鮑王波余冉王長永劉燕

（1.環境保護部南京環境科學研究所，南京 210042；2.東南大學能源與環境學院，南京 210096）

鵪鶉腸道微生物PCR-DGGE方法的優化

張振華1鮑王波2余冉2王長永1劉燕1

（1.環境保護部南京環境科學研究所，南京 210042；2.東南大學能源與環境學院，南京 210096）

通過對鵪鶉腸道微生物總DNA不同提取方法的效率進行比較，探討DNA質量以及PCR-DGGE反應條件對研究鵪鶉腸道微生物多樣性的影響。本試驗利用常規的飽和苯酚/氯仿法和3種試劑盒（QIAGEN試劑盒、上海生工試劑盒、天根試劑盒）方法提取鵪鶉腸道微生物總DNA，分別以細菌V3可變區引物和V6-V8可變區引物以及不同退火溫度進行PCR-DGGE分析。QIAGEN試劑盒法提取的腸道微生物總DNA的 A260/A280值在1.8-1.9之間，濃度約200 ng/μL，DGGE微生物多樣性條帶均勻度均高于其他3種提取方法。此外，利用不同引物擴增的DGGE圖譜發現，以V6-V8可變區引物擴增的DGGE圖譜條帶均勻，分離充分，較V3可變區更能反映鵪鶉腸道微生物種群的多樣性；同時，隨PCR退火溫度的升高，V6-V8可變區的微生物多樣性指數下降，V3可變區的微生物多樣性則無明顯變化。

鵪鶉；腸道微生物；總DNA提取；變性凝膠梯度電泳（DGGE）

DIO： 10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.01.011

動物腸道內定居著種類多數量龐大的微生物群，對宿主的生理和健康起著極其重要的作用。據研究統計，每克家禽盲腸內容物中約含微生物種類500-600種，數量107-1011個［1，2］。隨著動物腸道生態學研究的發展，單純的培養篩選法已無法滿足對腸道微生物多樣性研究的需要，分子生物學技術克服了傳統的微生物分離、培養和分類方法的局限性，迅速發展成為腸道微生物多樣性研究的常用技術［3］。目前，針對鳥類腸道微生物的現代分子生物學技術包括了16S rRNA基因克隆文庫、變性梯度凝膠電泳（Denatured gradient gel electrophoresis，DGGE）、 核酸分子雜交以及實時熒光定量PCR技術［4］。

由于DGGE技術能快速、有效的分析許多環境中優勢菌群的特異性差異，因而也非常適于動物腸道微環境中的微生物群落多樣性分析研究［5，6］。

鵪鶉不僅是一種高產特禽，而且被國內外廣泛作為環境及日糧毒性實驗中的模式鳥類展開相關研究。目前，有關動物腸道微生物的分子生態學研究主要集中在牛、豬、雞等主要的經濟畜禽動物，針對鵪鶉腸道微生物分子生態學方面的研究較少，大都參考傳統的平板菌落技術法來分離和測定其腸道主要微生物菌群的種類與數量［7］。因此，建立一套針對鵪鶉腸道微環境的PCR-DGGE方法對研究其微生物多樣性有重要意義。

不同研究者發現，DNA提取方法、PCR退火溫度及引物種類對PCR-DGGE法研究腸道微生物菌群多樣性有一定影響［8-10］。在DNA提取過程中，細胞裂解不徹底、抽提過程造成的DNA鏈斷裂及PCR抑制劑去除不徹底等因素將對PCR擴增效率產生影響［9］。PCR退火溫度也是影響DGGE條帶豐富度的重要因素。Sipos1等［11］的研究表明，在保證PCR條帶特異性的前提下，應盡可能降低退火溫度，以提高微生物多樣性指數。目前，基于16S rRNA基因序列的V1，V3，V1-V3，V6-V8可變區引物進行的腸道微生物多樣性研究都有報道［12-16］，其中V3和V6-V8可變區由于其DGGE圖譜的條帶分離效果好，條帶數目和亮度較好而被廣泛使用［17，18］。

本研究取鵪鶉腸道為試驗材料，比較了4種方法對腸道微生物總DNA的提取結果，研究了V3、V6-V8可變區引物以及不同退火溫度對PCR-DGGE分析結果的影響，旨在建立鵪鶉腸道微生物總DNA的最佳提取方法與PCR-DGGE優化條件，以便能更深刻地揭示鵪鶉腸道微生物菌群種類和豐度。

1 材料與方法

1.1 鵪鶉腸道食糜樣品的獲取

約90天齡的健康雌性日本鵪鶉于無菌條件下解剖，將3只鵪鶉直腸內容物取出，混合后置于1.5 mL無菌EP管，-80℃凍存備用（腸道樣品由南京中醫藥大學提供）。

1.2 鵪鶉腸道微生物總DNA的提取及檢測

CTAB提取法：參考文獻［19］。準確稱取鵪鶉直腸內容物0.2 g，加入700 μL CTAB抽提液、15 μL SDS、10 μL蛋白酶K，混勻后常溫裂解20 min；56℃溫浴2-3 h，10 000 r/min 離心10 min；提取上清液至新的離心管中，加入5 μL的RNase A（10 mg/mL），于37℃下水浴1 h，12 000 r/min 離心10 min；吸取上層水相于新的EP管中，加等體積苯酚/氯仿/異丙醇抽提2次直至界面清晰，異丙醇沉淀及70%乙醇洗滌，最后加入30 μL的1×TE溶解，-20℃保存備用。

試劑盒提取：準確稱取0.1 g鵪鶉直腸內容物，加500 μL PBS，冰上破碎20 s，10 000 r/min離心10 min，離心棄上清液，隨后按試劑盒說明書操作，提取的DNA于-20℃保存備用。

DNA檢測：取1 μL DNA，核酸定量儀測定其濃度及A260/A280值的結果判定。

1.3 PCR擴增及DGGE圖譜多樣性分析

V3區引物序列為：341 F（5'-CCTACGGGAGGCAGCAG-3'）；534 R（5'-ATTACCGCGGCTGCTGG -3'）［17］。V6-V8區引物序列：U968（5'-AACGCGAAGAACCTTAC-3'）；L1401（5'-CGGTGTGTACAAGACCC-3'）［18］。GC夾子（CGCCCGCCGCGCCCCGCG CCCGGCCCGCCGCCCCCGCCCC）。

PCR體系參考Zhou［18］研究方法，25 μL體系：2.5 μL 10×PCR buffer（Mg2+free），2 μL dNTP Mix，左右引物各0.5 μL，1.5 μL MgCl2，0.3 μL Taq酶，DNA模板50 ng，ddH2O 17 μL。反應條件：94℃預變性3 min；94℃變性30 s，3個不同溫度下退火30 s，72℃延伸1 min，35個循環；72℃保持5 min。退火溫度設置如下梯度：V3區：55℃、60℃、65℃；V6-V8區：50℃、55℃、60℃。擴增產物5 μL進行1.5%的瓊脂糖電泳，1×TAE電泳液，紫外凝膠成像儀（Bio-Rad，USA）成像。Gelred染料，DL2000 Marker。

DGGE參考Torok等［20］試驗方法，使用8%的聚丙烯酰胺（37.5∶1 acrylamide∶bisacrylamide）凝膠，預試驗確定變性范圍：V3區：40%-60%；V6-V8區：30%-50%（100%的變性劑中含有7 mol/L的尿素和40%的去離子甲酰胺），蠕動泵自動灌膠。每條泳道加反應體系樣20 μL，1×TAE電泳液，60℃，200 V預跑10 min，隨后60 V電泳17 h，SYBR Green I染色40 min后掃描成像。DGGE圖譜使用Quantity one軟件分析后將條帶信息轉移到Excel工作表中進行后期多樣性分析。Quantity one軟件自動計算出每個條帶的豐度值，由此計算出每個泳道條帶數S，并計算每條泳道的Shanoon指數H和均勻度E。其中：Pi=ni/N，ni為第i個條帶的豐度值，N為第i個條帶的泳道上所有條帶豐度之和［4］。

2 結果

2.1 四種方法提取的鵪鶉腸道微生物總DNA濃度及純度比較

如圖1所示，在使用相同腸道樣本情況下，不同方法獲得鵪鶉腸道微生物總DNA濃度表明，天根試劑盒法＞QIAGEN試劑盒法＞酚-氯仿法＞生工試劑盒法；純度（A260/A280值）表明，QIAGEN試劑盒法和生工試劑盒法最優，天根試劑盒法和酚-氯仿法則表現出不同程度的污染。

圖1 四種方法提取的鵪鶉腸道總DNA濃度和純度

對4種提取方法的鵪鶉腸道微生物總DNA分別在55℃、60℃、65℃退火溫度下，以16S rRNA V3和V6-V8可變區引物進行擴增。結果如圖2所示，4種方法提取的鵪鶉腸道微生物總DNA都得到預期大小的目的條帶。酚-氯仿法處理樣品的目的條帶亮度較低，說明其DNA模板中含有某些PCR抑制因子［21］。V6-V8可變區引物的擴增產物都出現了引物二聚體，而V3可變區引物的擴增產物只在酚-氯仿法提取的DNA模板中出現。退火溫度對4種提取方法提取的鵪鶉腸道微生物總DNA的PCR擴增效率無顯著影響。

圖2 比較不同提取方法引物及退火溫度下的PCR產物瓊脂糖電泳圖

2.2 DGGE圖譜及微生物多樣性分析

為進一步探討不同提取方法、退火溫度以及引物對鵪鶉腸道微生物多樣性的影響，試驗對鵪鶉腸道微生物總DNA的PCR產物進行了DGGE電泳分析。以V3可變區引物擴增的DGGE電泳圖譜以及戴斯系數分析結果，如圖3-A所示。QIAGEN試劑盒法和天根試劑盒法提取的DNA模板PCR擴增產物得到的DGGE條帶數較多，3種不同退火溫度下，平均值分別為21和27。而生工試劑盒法與酚-氯仿法提取的總DNA模板PCR-DGGE圖譜條帶數平均值分別為11和18。在3種不同退火溫度條件下，4種提取方法得到的PCR-DGGE圖譜條帶數并未隨退火溫度升高而減少。在60℃和65℃退火溫度條件下，4種提取方法的條帶豐富度較高且相對穩定。Shannon指數分析結果（表1）表示，在V3可變區，4種提取方法的微生物多樣性指數從高到低分別為天根試劑盒法、QIAGEN試劑盒法、酚-氯仿法和生工試劑盒法，最佳退火溫度為60℃。

以V6-V8可變區引物擴增的DGGE電泳圖譜以及戴斯系數分析結果，如圖3-B所示。QIAGEN試劑盒法和生工試劑盒法提取的DNA模板PCR擴增產物得到的DGGE條帶數較多，3個不同退火溫度下，平均值分別為20和27。天根試劑盒法與酚-氯仿法提取的總DNA模板PCR-DGGE圖譜條帶數平均值分別為16和13。和V3可變區分析結果不同的是，四種提取方法的PCR-DGGE圖譜的條帶數都隨著退火溫度升高而減少。表1的Shannon指數分析也說明，在V6-V8可變區，50℃退火溫度條件下，4種提取方法的微生物多樣性指數最高。

圖3 比較不同提取方法引物下的DGGE指紋圖譜

表1 比較不同提取方法引物及退火溫度下的微生物多樣性指數分析

比較V3可變區和V6-V8可變區的PCR-DGGE圖譜可以發現，V3可變區的微生物種類大多聚集于泳道上部，且不同條帶的豐度值差異較大，均勻度E值都在0.90左右。V6-V8可變區的微生物種類則均勻的分布于整個泳道，且不同條帶的豐度值差異較小，均勻度E值均在0.99左右。

3 討論

PCR-DGGE作為一種現代分子生物學技術，給研究動物腸道微生物多樣性提供了一種準確、高效的方法［9］。本試 驗以鵪鶉腸道為研究材料，探討了提取腸道微生物總DNA的4種方法，V3、V6-V8可變區通用引物以及不同退火溫度對PCR-DGGE分析結果的影響。

試驗表明，QIAGEN試劑盒法提取的鵪鶉腸道微生物總DNA濃度及純度均較高，PCR-DGGE分析結果表明微生物多樣性指數較高，整體表現最優；天根試劑盒法和生工試劑盒法次之；酚-氯仿法提取的鵪鶉腸道微生物總DNA有蛋白或酚類物質污染，對PCR擴增有一定抑制作用，但都能基本滿足PCR-DGGE分析要求。

研究不同引物對PCR-DGGE的影響發現，V6-V8可變區較V3可變區更能反映鵪鶉腸道微生物種群的多樣性。可能由于鵪鶉腸道微生物種類相對較少而種間水平豐富，而V3可變區較短（190 bp左右），DNA鏈之間堿基差異小，因此很難將同屬不同種的優勢菌群有效分離，導致在DGGE圖譜上顯示某些條帶豐度值很高，均勻度下降。而V6-V8可變區大小在450 bp左右，條帶能較均勻的分布在DGGE圖譜上，均勻度較高。Hong等［17］用V3可變區通用引物研究豬腸道微生物時發現，由于擴增片段太短，導致很難將細菌種類有效區分。Yu等［5］研究腸道微生物多樣性時也發現V6-V8區的E值也高于V3區。

綜上所述，就鵪鶉腸道微生物多樣性的PCRDGGE分析方法而言，QIAGEN試劑盒法對腸道微生物總DNA的提取效果最好；V6-V8可變區的PCRDGGE圖譜條帶清晰、分布均勻、分離充分，能更客觀的反映鵪鶉腸道微生物菌群結構；以V6-V8可變區進行PCR擴增時，可通過降低退火溫度來增加DGGE條帶數量。

4 結論

本研究以鵪鶉腸道微生物總DNA為模板，比較4種DNA提取方法、兩對16S rRNA可變區引物、3個退火溫度對PCR-DGGE法研究鵪鶉腸道微生物多樣性的影響。研究結果表明，V6-V8可變區引物及55℃退火溫度更能客觀的反映鵪鶉腸道微生物菌群結構。

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（責任編輯 狄艷紅）

Optimization Method for the Extraction of Total DNA from the Intestinal Microbes in Quails

Zhang Zhenhua1Bao Wangbo2Yu Ran2Wang Changyong1Liu Yan1
（1. Nanjing Institute of Environmental Sciences，MEP，Nanjing 210042；2. Department of Energy and Environment，Southeast University，Nanjing 210096）

Comparing the effects of total DNA extracted by different methods from intestinal microbes in quails， the study aimed at investigating the influences of DNA quality and PCR-DGGE conditions on intestinal microbial diversity of quail. In this study， the experiment used four methods to extract the DNA. The first was a conventional method for using saturated phenol/chloroform， other three commercially available DNA extraction kits（QIAGEN， SHENGGONG， TIANGEN）were assessed. The ribosomal gene sequences were amplified with V3 and V6-V8 hypervariable region universal primers at different annealing temperature and subjected to denaturing gradient gel electrophoresis（DGGE）. The QIAGEN DNA Kit generated the greatest bacterial species eveness and DNA quantity and quality in compare with other methods（A260/A280=1.8， 200 ng/μL）. The resulting DGGE profiles were substantially different in terms of the number and relative intensity of the amplification products. The V6-V8 region produced better DGGE profiles than V3 region. The QIAGEN DNA Kit and V6-V8 hypervariable region universal primers will be used in future studies of intestinal microbial diversity of quail.

quail；ntestinal microbes；DNA extraction；DGGE

2014-06-09

轉基因生物新品種培育重大專項（2013ZX08011-003，2014ZX08011-003，2013ZX08012-005，2014ZX08012-005），環保公益行業專項（201309038）

張振華，男，博士，研究方向：微生物學；E-mail：zzh@nies.org

劉燕，女，副研究員，研究方向：生物安全與生物多樣性保護；E-mail：liuyan@nies.org