鵪鶉腸道微生物PCR-DGGE方法的優(yōu)化

張振華鮑王波余冉王長永劉燕

（1.環(huán)境保護(hù)部南京環(huán)境科學(xué)研究所，南京 210042；2.東南大學(xué)能源與環(huán)境學(xué)院，南京 210096）

鵪鶉腸道微生物PCR-DGGE方法的優(yōu)化

張振華1鮑王波2余冉2王長永1劉燕1

（1.環(huán)境保護(hù)部南京環(huán)境科學(xué)研究所，南京 210042；2.東南大學(xué)能源與環(huán)境學(xué)院，南京 210096）

通過對(duì)鵪鶉腸道微生物總DNA不同提取方法的效率進(jìn)行比較，探討DNA質(zhì)量以及PCR-DGGE反應(yīng)條件對(duì)研究鵪鶉腸道微生物多樣性的影響。本試驗(yàn)利用常規(guī)的飽和苯酚/氯仿法和3種試劑盒（QIAGEN試劑盒、上海生工試劑盒、天根試劑盒）方法提取鵪鶉腸道微生物總DNA，分別以細(xì)菌V3可變區(qū)引物和V6-V8可變區(qū)引物以及不同退火溫度進(jìn)行PCR-DGGE分析。QIAGEN試劑盒法提取的腸道微生物總DNA的 A260/A280值在1.8-1.9之間，濃度約200 ng/μL，DGGE微生物多樣性條帶均勻度均高于其他3種提取方法。此外，利用不同引物擴(kuò)增的DGGE圖譜發(fā)現(xiàn)，以V6-V8可變區(qū)引物擴(kuò)增的DGGE圖譜條帶均勻，分離充分，較V3可變區(qū)更能反映鵪鶉腸道微生物種群的多樣性；同時(shí)，隨PCR退火溫度的升高，V6-V8可變區(qū)的微生物多樣性指數(shù)下降，V3可變區(qū)的微生物多樣性則無明顯變化。

鵪鶉；腸道微生物；總DNA提取；變性凝膠梯度電泳（DGGE）

DIO： 10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.01.011

動(dòng)物腸道內(nèi)定居著種類多數(shù)量龐大的微生物群，對(duì)宿主的生理和健康起著極其重要的作用。據(jù)研究統(tǒng)計(jì)，每克家禽盲腸內(nèi)容物中約含微生物種類500-600種，數(shù)量107-1011個(gè)［1，2］。隨著動(dòng)物腸道生態(tài)學(xué)研究的發(fā)展，單純的培養(yǎng)篩選法已無法滿足對(duì)腸道微生物多樣性研究的需要，分子生物學(xué)技術(shù)克服了傳統(tǒng)的微生物分離、培養(yǎng)和分類方法的局限性，迅速發(fā)展成為腸道微生物多樣性研究的常用技術(shù)［3］。目前，針對(duì)鳥類腸道微生物的現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)包括了16S rRNA基因克隆文庫、變性梯度凝膠電泳（Denatured gradient gel electrophoresis，DGGE）、 核酸分子雜交以及實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)［4］。

由于DGGE技術(shù)能快速、有效的分析許多環(huán)境中優(yōu)勢菌群的特異性差異，因而也非常適于動(dòng)物腸道微環(huán)境中的微生物群落多樣性分析研究［5，6］。

鵪鶉不僅是一種高產(chǎn)特禽，而且被國內(nèi)外廣泛作為環(huán)境及日糧毒性實(shí)驗(yàn)中的模式鳥類展開相關(guān)研究。目前，有關(guān)動(dòng)物腸道微生物的分子生態(tài)學(xué)研究主要集中在牛、豬、雞等主要的經(jīng)濟(jì)畜禽動(dòng)物，針對(duì)鵪鶉腸道微生物分子生態(tài)學(xué)方面的研究較少，大都參考傳統(tǒng)的平板菌落技術(shù)法來分離和測定其腸道主要微生物菌群的種類與數(shù)量［7］。因此，建立一套針對(duì)鵪鶉腸道微環(huán)境的PCR-DGGE方法對(duì)研究其微生物多樣性有重要意義。

不同研究者發(fā)現(xiàn)，DNA提取方法、PCR退火溫度及引物種類對(duì)PCR-DGGE法研究腸道微生物菌群多樣性有一定影響［8-10］。在DNA提取過程中，細(xì)胞裂解不徹底、抽提過程造成的DNA鏈斷裂及PCR抑制劑去除不徹底等因素將對(duì)PCR擴(kuò)增效率產(chǎn)生影響［9］。PCR退火溫度也是影響DGGE條帶豐富度的重要因素。Sipos1等［11］的研究表明，在保證PCR條帶特異性的前提下，應(yīng)盡可能降低退火溫度，以提高微生物多樣性指數(shù)。目前，基于16S rRNA基因序列的V1，V3，V1-V3，V6-V8可變區(qū)引物進(jìn)行的腸道微生物多樣性研究都有報(bào)道［12-16］，其中V3和V6-V8可變區(qū)由于其DGGE圖譜的條帶分離效果好，條帶數(shù)目和亮度較好而被廣泛使用［17，18］。

本研究取鵪鶉腸道為試驗(yàn)材料，比較了4種方法對(duì)腸道微生物總DNA的提取結(jié)果，研究了V3、V6-V8可變區(qū)引物以及不同退火溫度對(duì)PCR-DGGE分析結(jié)果的影響，旨在建立鵪鶉腸道微生物總DNA的最佳提取方法與PCR-DGGE優(yōu)化條件，以便能更深刻地揭示鵪鶉腸道微生物菌群種類和豐度。

1 材料與方法

1.1 鵪鶉腸道食糜樣品的獲取

約90天齡的健康雌性日本鵪鶉于無菌條件下解剖，將3只鵪鶉直腸內(nèi)容物取出，混合后置于1.5 mL無菌EP管，-80℃凍存?zhèn)溆茫c道樣品由南京中醫(yī)藥大學(xué)提供）。

1.2 鵪鶉腸道微生物總DNA的提取及檢測

CTAB提取法：參考文獻(xiàn)［19］。準(zhǔn)確稱取鵪鶉直腸內(nèi)容物0.2 g，加入700 μL CTAB抽提液、15 μL SDS、10 μL蛋白酶K，混勻后常溫裂解20 min；56℃溫浴2-3 h，10 000 r/min 離心10 min；提取上清液至新的離心管中，加入5 μL的RNase A（10 mg/mL），于37℃下水浴1 h，12 000 r/min 離心10 min；吸取上層水相于新的EP管中，加等體積苯酚/氯仿/異丙醇抽提2次直至界面清晰，異丙醇沉淀及70%乙醇洗滌，最后加入30 μL的1×TE溶解，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

試劑盒提取：準(zhǔn)確稱取0.1 g鵪鶉直腸內(nèi)容物，加500 μL PBS，冰上破碎20 s，10 000 r/min離心10 min，離心棄上清液，隨后按試劑盒說明書操作，提取的DNA于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

DNA檢測：取1 μL DNA，核酸定量儀測定其濃度及A260/A280值的結(jié)果判定。

1.3 PCR擴(kuò)增及DGGE圖譜多樣性分析

V3區(qū)引物序列為：341 F（5'-CCTACGGGAGGCAGCAG-3'）；534 R（5'-ATTACCGCGGCTGCTGG -3'）［17］。V6-V8區(qū)引物序列：U968（5'-AACGCGAAGAACCTTAC-3'）；L1401（5'-CGGTGTGTACAAGACCC-3'）［18］。GC夾子（CGCCCGCCGCGCCCCGCG CCCGGCCCGCCGCCCCCGCCCC）。

PCR體系參考Zhou［18］研究方法，25 μL體系：2.5 μL 10×PCR buffer（Mg2+free），2 μL dNTP Mix，左右引物各0.5 μL，1.5 μL MgCl2，0.3 μL Taq酶，DNA模板50 ng，ddH2O 17 μL。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性3 min；94℃變性30 s，3個(gè)不同溫度下退火30 s，72℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；72℃保持5 min。退火溫度設(shè)置如下梯度：V3區(qū)：55℃、60℃、65℃；V6-V8區(qū)：50℃、55℃、60℃。擴(kuò)增產(chǎn)物5 μL進(jìn)行1.5%的瓊脂糖電泳，1×TAE電泳液，紫外凝膠成像儀（Bio-Rad，USA）成像。Gelred染料，DL2000 Marker。

DGGE參考Torok等［20］試驗(yàn)方法，使用8%的聚丙烯酰胺（37.5∶1 acrylamide∶bisacrylamide）凝膠，預(yù)試驗(yàn)確定變性范圍：V3區(qū)：40%-60%；V6-V8區(qū)：30%-50%（100%的變性劑中含有7 mol/L的尿素和40%的去離子甲酰胺），蠕動(dòng)泵自動(dòng)灌膠。每條泳道加反應(yīng)體系樣20 μL，1×TAE電泳液，60℃，200 V預(yù)跑10 min，隨后60 V電泳17 h，SYBR Green I染色40 min后掃描成像。DGGE圖譜使用Quantity one軟件分析后將條帶信息轉(zhuǎn)移到Excel工作表中進(jìn)行后期多樣性分析。Quantity one軟件自動(dòng)計(jì)算出每個(gè)條帶的豐度值，由此計(jì)算出每個(gè)泳道條帶數(shù)S，并計(jì)算每條泳道的Shanoon指數(shù)H和均勻度E。其中：Pi=ni/N，ni為第i個(gè)條帶的豐度值，N為第i個(gè)條帶的泳道上所有條帶豐度之和［4］。

2 結(jié)果

2.1 四種方法提取的鵪鶉腸道微生物總DNA濃度及純度比較

如圖1所示，在使用相同腸道樣本情況下，不同方法獲得鵪鶉腸道微生物總DNA濃度表明，天根試劑盒法＞QIAGEN試劑盒法＞酚-氯仿法＞生工試劑盒法；純度（A260/A280值）表明，QIAGEN試劑盒法和生工試劑盒法最優(yōu)，天根試劑盒法和酚-氯仿法則表現(xiàn)出不同程度的污染。

圖1 四種方法提取的鵪鶉腸道總DNA濃度和純度

對(duì)4種提取方法的鵪鶉腸道微生物總DNA分別在55℃、60℃、65℃退火溫度下，以16S rRNA V3和V6-V8可變區(qū)引物進(jìn)行擴(kuò)增。結(jié)果如圖2所示，4種方法提取的鵪鶉腸道微生物總DNA都得到預(yù)期大小的目的條帶。酚-氯仿法處理樣品的目的條帶亮度較低，說明其DNA模板中含有某些PCR抑制因子［21］。V6-V8可變區(qū)引物的擴(kuò)增產(chǎn)物都出現(xiàn)了引物二聚體，而V3可變區(qū)引物的擴(kuò)增產(chǎn)物只在酚-氯仿法提取的DNA模板中出現(xiàn)。退火溫度對(duì)4種提取方法提取的鵪鶉腸道微生物總DNA的PCR擴(kuò)增效率無顯著影響。

圖2 比較不同提取方法引物及退火溫度下的PCR產(chǎn)物瓊脂糖電泳圖

2.2 DGGE圖譜及微生物多樣性分析

為進(jìn)一步探討不同提取方法、退火溫度以及引物對(duì)鵪鶉腸道微生物多樣性的影響，試驗(yàn)對(duì)鵪鶉腸道微生物總DNA的PCR產(chǎn)物進(jìn)行了DGGE電泳分析。以V3可變區(qū)引物擴(kuò)增的DGGE電泳圖譜以及戴斯系數(shù)分析結(jié)果，如圖3-A所示。QIAGEN試劑盒法和天根試劑盒法提取的DNA模板PCR擴(kuò)增產(chǎn)物得到的DGGE條帶數(shù)較多，3種不同退火溫度下，平均值分別為21和27。而生工試劑盒法與酚-氯仿法提取的總DNA模板PCR-DGGE圖譜條帶數(shù)平均值分別為11和18。在3種不同退火溫度條件下，4種提取方法得到的PCR-DGGE圖譜條帶數(shù)并未隨退火溫度升高而減少。在60℃和65℃退火溫度條件下，4種提取方法的條帶豐富度較高且相對(duì)穩(wěn)定。Shannon指數(shù)分析結(jié)果（表1）表示，在V3可變區(qū)，4種提取方法的微生物多樣性指數(shù)從高到低分別為天根試劑盒法、QIAGEN試劑盒法、酚-氯仿法和生工試劑盒法，最佳退火溫度為60℃。

以V6-V8可變區(qū)引物擴(kuò)增的DGGE電泳圖譜以及戴斯系數(shù)分析結(jié)果，如圖3-B所示。QIAGEN試劑盒法和生工試劑盒法提取的DNA模板PCR擴(kuò)增產(chǎn)物得到的DGGE條帶數(shù)較多，3個(gè)不同退火溫度下，平均值分別為20和27。天根試劑盒法與酚-氯仿法提取的總DNA模板PCR-DGGE圖譜條帶數(shù)平均值分別為16和13。和V3可變區(qū)分析結(jié)果不同的是，四種提取方法的PCR-DGGE圖譜的條帶數(shù)都隨著退火溫度升高而減少。表1的Shannon指數(shù)分析也說明，在V6-V8可變區(qū)，50℃退火溫度條件下，4種提取方法的微生物多樣性指數(shù)最高。

圖3 比較不同提取方法引物下的DGGE指紋圖譜

表1 比較不同提取方法引物及退火溫度下的微生物多樣性指數(shù)分析

比較V3可變區(qū)和V6-V8可變區(qū)的PCR-DGGE圖譜可以發(fā)現(xiàn)，V3可變區(qū)的微生物種類大多聚集于泳道上部，且不同條帶的豐度值差異較大，均勻度E值都在0.90左右。V6-V8可變區(qū)的微生物種類則均勻的分布于整個(gè)泳道，且不同條帶的豐度值差異較小，均勻度E值均在0.99左右。

3 討論

PCR-DGGE作為一種現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)，給研究動(dòng)物腸道微生物多樣性提供了一種準(zhǔn)確、高效的方法［9］。本試 驗(yàn)以鵪鶉腸道為研究材料，探討了提取腸道微生物總DNA的4種方法，V3、V6-V8可變區(qū)通用引物以及不同退火溫度對(duì)PCR-DGGE分析結(jié)果的影響。

試驗(yàn)表明，QIAGEN試劑盒法提取的鵪鶉腸道微生物總DNA濃度及純度均較高，PCR-DGGE分析結(jié)果表明微生物多樣性指數(shù)較高，整體表現(xiàn)最優(yōu)；天根試劑盒法和生工試劑盒法次之；酚-氯仿法提取的鵪鶉腸道微生物總DNA有蛋白或酚類物質(zhì)污染，對(duì)PCR擴(kuò)增有一定抑制作用，但都能基本滿足PCR-DGGE分析要求。

研究不同引物對(duì)PCR-DGGE的影響發(fā)現(xiàn)，V6-V8可變區(qū)較V3可變區(qū)更能反映鵪鶉腸道微生物種群的多樣性。可能由于鵪鶉腸道微生物種類相對(duì)較少而種間水平豐富，而V3可變區(qū)較短（190 bp左右），DNA鏈之間堿基差異小，因此很難將同屬不同種的優(yōu)勢菌群有效分離，導(dǎo)致在DGGE圖譜上顯示某些條帶豐度值很高，均勻度下降。而V6-V8可變區(qū)大小在450 bp左右，條帶能較均勻的分布在DGGE圖譜上，均勻度較高。Hong等［17］用V3可變區(qū)通用引物研究豬腸道微生物時(shí)發(fā)現(xiàn)，由于擴(kuò)增片段太短，導(dǎo)致很難將細(xì)菌種類有效區(qū)分。Yu等［5］研究腸道微生物多樣性時(shí)也發(fā)現(xiàn)V6-V8區(qū)的E值也高于V3區(qū)。

綜上所述，就鵪鶉腸道微生物多樣性的PCRDGGE分析方法而言，QIAGEN試劑盒法對(duì)腸道微生物總DNA的提取效果最好；V6-V8可變區(qū)的PCRDGGE圖譜條帶清晰、分布均勻、分離充分，能更客觀的反映鵪鶉腸道微生物菌群結(jié)構(gòu)；以V6-V8可變區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，可通過降低退火溫度來增加DGGE條帶數(shù)量。

4 結(jié)論

本研究以鵪鶉腸道微生物總DNA為模板，比較4種DNA提取方法、兩對(duì)16S rRNA可變區(qū)引物、3個(gè)退火溫度對(duì)PCR-DGGE法研究鵪鶉腸道微生物多樣性的影響。研究結(jié)果表明，V6-V8可變區(qū)引物及55℃退火溫度更能客觀的反映鵪鶉腸道微生物菌群結(jié)構(gòu)。

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（責(zé)任編輯 狄艷紅）

Optimization Method for the Extraction of Total DNA from the Intestinal Microbes in Quails

Zhang Zhenhua1Bao Wangbo2Yu Ran2Wang Changyong1Liu Yan1
（1. Nanjing Institute of Environmental Sciences，MEP，Nanjing 210042；2. Department of Energy and Environment，Southeast University，Nanjing 210096）

Comparing the effects of total DNA extracted by different methods from intestinal microbes in quails， the study aimed at investigating the influences of DNA quality and PCR-DGGE conditions on intestinal microbial diversity of quail. In this study， the experiment used four methods to extract the DNA. The first was a conventional method for using saturated phenol/chloroform， other three commercially available DNA extraction kits（QIAGEN， SHENGGONG， TIANGEN）were assessed. The ribosomal gene sequences were amplified with V3 and V6-V8 hypervariable region universal primers at different annealing temperature and subjected to denaturing gradient gel electrophoresis（DGGE）. The QIAGEN DNA Kit generated the greatest bacterial species eveness and DNA quantity and quality in compare with other methods（A260/A280=1.8， 200 ng/μL）. The resulting DGGE profiles were substantially different in terms of the number and relative intensity of the amplification products. The V6-V8 region produced better DGGE profiles than V3 region. The QIAGEN DNA Kit and V6-V8 hypervariable region universal primers will be used in future studies of intestinal microbial diversity of quail.

quail；ntestinal microbes；DNA extraction；DGGE

2014-06-09

轉(zhuǎn)基因生物新品種培育重大專項(xiàng)（2013ZX08011-003，2014ZX08011-003，2013ZX08012-005，2014ZX08012-005），環(huán)保公益行業(yè)專項(xiàng)（201309038）

張振華，男，博士，研究方向：微生物學(xué)；E-mail：zzh@nies.org

劉燕，女，副研究員，研究方向：生物安全與生物多樣性保護(hù)；E-mail：liuyan@nies.org