響應面法優(yōu)化香菇多糖的超聲輔助提取工藝

萬閱齊計英曾紅韓陽韓靜

（1.沈陽藥科大學制藥工程學院，沈陽 110016；2.遼寧中醫(yī)藥大學藥學院，沈陽 110032）

響應面法優(yōu)化香菇多糖的超聲輔助提取工藝

萬閱1齊計英1曾紅1韓陽2韓靜1

（1.沈陽藥科大學制藥工程學院，沈陽 110016；2.遼寧中醫(yī)藥大學藥學院，沈陽 110032）

為了開發(fā)利用香菇資源，采用超聲輔助法提取香菇中的多糖，利用響應面法優(yōu)化超聲輔助提取法提取香菇多糖的工藝條件。首先進行單因素試驗考察，在單因素試驗的基礎上，選擇超聲波功率、超聲時間及料液比為自變量，以多糖得率為響應值，采用Box-Benhnken法設計3因素3水平響應面設計試驗。結(jié)果表明，響應面模型與實際情況擬合良好，能較好地預測香菇多糖得率。最佳工藝：超聲波功率300 W、超聲波處理時間25 min、料液比1∶30，多糖得率25.71%，與理論值（25.55%）相比，相對誤差較小，為0.63%。與傳統(tǒng)熱水浸提法比較，超聲波提取法多糖得率較高，且耗時少，是理想的香菇多糖提取方法。

熱水浸提；超聲輔助提取；多糖得率；響應面優(yōu)化；單因素試驗

DIO： 10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.01.012

香菇多糖（Lentinan）是從香菇中提取的有效活性成分?，F(xiàn)代醫(yī)學及營養(yǎng)學等各領域?qū)ζ洳粩嗌钊胙芯浚愎蕉嗵堑乃幱脙r值也不斷被發(fā)掘。研究表明香菇多糖的活性成分β-（1-3）-D葡聚糖對抑制異源、同源，甚至遺傳性的腫瘤都有效，且毒副作用?。?］。香菇多糖也具有抗病毒、增強人體免疫力等功能，在食品、藥品、保健品等方面具有廣闊的前景［2］。超聲波輔助提取技術(shù)是利用超聲波粉碎技術(shù)，使生藥中心粒徑在5-10 μm以下，細胞破壁率達到95%，藥效成分易于提取也易于人體吸收這種新技術(shù)的應用，不僅適用于各種質(zhì)地不同的藥材，而且可使其中有效成分直接暴露出來，從而使藥材成分的溶出和起效更加迅速完全。與傳統(tǒng)提取方法相比，具有效率高，能耗低等特點［3］。

目前已報道的香菇多糖提取包括各種提取方法及各種因素對其得率的影響，已有的模型也只是單因素對其多糖得率的影響，各因素之間的交互作用的報道較少。本試驗采用響應面法［4］進行試驗設計、數(shù)據(jù)分析，考察超聲波功率、超聲時間、提取溫度3個因素的交互作用對香菇多糖得率的影響，旨在為香菇多糖在食品、藥品領域的發(fā)展提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

干香菇（市售）、葡萄糖、苯酚、濃硫酸、無水乙醇等均為分析純。

RRHP200型萬能高速粉碎機：歐凱萊芙（香港）實業(yè)公司；jy92-2d型超聲波細胞粉碎機：寧波新芝生物科技股份有限公司；電子天平：賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；df-101s集熱式恒溫磁力攪拌器：鞏義市予華儀器有限公司；80-2型離心沉淀機：姜堰市新康醫(yī)療器械有限公司；uv2800pc型紫外可見分光光度計：尤尼科儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 工藝流程 干香菇→粉碎→香菇粉末→超聲輔助提取→離心（3 000 r/min）→取上清液→定容，測量吸光度→計算香菇多糖得率。

1.2.2 標準曲線的繪制 取105℃烘干至恒重的葡萄糖2.5 g定容于50 mL容量瓶中，配成50 mg/mL的葡萄糖標準溶液。精密移取葡萄糖標準溶液0、1、2.5、4、5.5和7 mL定容于50 mL容量瓶中配制成0.02、0.05、0.08、0.11和0.14 mg/mL葡萄糖溶液。分別移取上述葡萄糖溶液2 mL，加入6%苯酚溶液1 mL，迅速加入濃硫酸5 mL，震蕩搖勻，沸水浴加熱15 min，冷卻30 min，測定490 nm處溶液的吸光值。得標準曲線回歸方程為：y=7.81x-0.081 6，R2=0.994 5。

1.2.3 香菇多糖含量測定 試驗采用苯酚-硫酸法進行香菇多糖含量測定。具體步驟如下：取2 mL香菇多糖提取液置20 mL具塞玻璃試管中，向溶液中加入1.0 mL 5%苯酚溶液，然后快速且與液面垂直加入5 mL濃硫酸，渦旋震蕩，將試管置于30℃水浴加熱20 min，在紫外分光光度計490 nm處測量吸光度。將吸光值帶入標準曲線方程，計算得香菇多糖濃度。再將多糖濃度帶入下式計算得香菇多糖得率。

其中，C是測得吸光度對應的濃度，V是提取液的體積，m是原料干重。

1.2.4 單因素試驗 按工藝流程方法提取香菇多糖，選取超聲波功率（100、200、300、400和500 W）、超聲時間（10、15、20、25、30、35和40 min、）、料液比（1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50）以及反應溫度（40℃、50℃、60℃、70℃和80℃）幾個因素進行單因素試驗，以香菇多糖得率為考察指標，探究各因素對香菇多糖得率的影響。

1.2.5 響應面試驗設計 在單因素試驗的基礎上，選取超聲波功率、超聲時間、料液比為自變量，多糖得率為響應值，進行3因素3水平響應面分析，采用 Box-Benhnken法對香菇多糖的提取工藝進行優(yōu)化。試驗因素水平設計表，見表1。

表1 因素和水平Box-Benhnken設計表

2 結(jié)果

圖1 超聲波功率對香菇多糖得率的影響

2.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1 超聲波功率對香菇多糖得率的影響 超聲波功率對香菇多糖得率的影響（圖1）表明，隨著超聲功率的增大，香菇多糖得率增大，在 300 W時多糖得率出現(xiàn)最大值。但超聲功率繼續(xù)增大，香菇多糖得率反而降低。因此選擇超聲功率為300 W進行響應面優(yōu)化試驗。

2.1.2 超聲時間對香菇多糖得率的影響 超聲時間對香菇多糖得率的影響（圖2）表明，隨著超聲時間的延長，香菇多糖得率呈現(xiàn)逐漸增大的趨勢，超過25 min后，多糖得率逐漸下降，在25 min時出現(xiàn)最大值。圖2顯示，超聲時間為20 min所對應的多糖得率與25 min所對應的最大值相差不大，考慮到超聲波所產(chǎn)生的耗費問題，選擇超聲時間為20 min進行響應面優(yōu)化試驗。

圖2 超聲時間對香菇多糖得率的影響

2.1.3 料液比對香菇多糖得率的影響 液料比對香菇多糖得率的影響（圖3）表明，隨著液料比的增加，香菇多糖得率呈現(xiàn)逐漸增大的趨勢，在液料比為30∶1處，多糖得率趨于平緩?？紤]到節(jié)約原料的問題，選擇液料比為30∶1進行響應面優(yōu)化試驗。

圖3 液/料比對香菇多糖得率的影響

2.1.4 反應溫度對香菇多糖得率的影響 反應溫度對香菇多糖得率的影響（圖4）表明，隨著反應溫度的升高，香菇多糖得率呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢，在溫度為60℃時，多糖得率出現(xiàn)最大值，但圖4顯示，各溫度所對應的多糖得率最大值與最小值間相差不大，因此選擇反應溫度為60℃進行試驗，但不選擇反應溫進行響應面優(yōu)化試驗。

圖4 反應溫度對香菇多糖得率的影響

2.2 響應面優(yōu)化試驗結(jié)果

2.2.1 響應面試驗設計及結(jié)果 根據(jù)Box-Benhnken法設計原理，在單因素試驗基礎上，選取超聲波功率、料液比、超聲時間為自變量，香菇多糖得率為響應值，進行3因素3水平響應面試驗設計。根據(jù)軟件設計，香菇多糖提取條件的優(yōu)化試驗共有17組，試驗設計及響應值結(jié)果如表2所示。

表2 響應面試驗設計及結(jié)果

2.2.2 數(shù)學模型的建立和數(shù)據(jù)分析 根據(jù)所得試驗數(shù)據(jù)采用軟件Design-Expert 7.1.3進行多元回歸擬合，得到多糖得率（Y）對試驗因素的二次多項回歸方程：

方程中各項系數(shù)絕對值的大小直接反映各因素對響應值的影響程度，系數(shù)的正、負反映了影響的方向［5］。 由于方程的二次項系數(shù)均為負值，可以推斷方程代表的拋物面開口向下，因而具有極大值點，可以進行優(yōu)化分析［6］。由方程的一次項系數(shù)可以得出，影響超聲波輔助提取法的香菇多糖得率的因素的主次順序為：超聲時間，料液比，超聲功率。

對模型進行方差分析，結(jié)果（表3）顯示，方程的模型顯著性P＜0.000 1，是極顯著的，說明模型有意義；失擬差＞0. 05，不顯著，即模型與試驗值的差異較小說明該模型能解釋97.70%的響應值的變化；相關系數(shù)R2=0.989 9＞0.9，說明該模型擬合程度良好，預測值與實測值之間有較好的相關性，試驗誤差較小，可以用回歸方程代替試驗真實點對試驗結(jié)果進行分析和預測［7］。表中一次項、交互項和二次項中都有顯著性因素。一次項A、C達到極顯著水平，B達到顯著水平；交互項AC、BC達到顯著水平；二次項A2、B2達到極顯著水平，C2達到顯著水平。從表中各因素的F值和P值可知，超聲時間對香菇多糖得率的影響最大；其次是料液比和超聲功率。

表3 回歸分析表

2.2.3 響應面分析圖 根據(jù)回歸方程建立響應曲面圖，考察響應曲面形狀，分析超聲波功率、料液比、超聲時間對響應值香菇多糖得率的影響。各因素之間的交互作用對香菇多糖得率影響的響應面圖如圖5-7所示。圖中能夠看出多糖得率（Y）隨超聲時間的加長而先增大后減小，在中心點處出現(xiàn)峰值。料液比的改變也會不同程度的影響多糖得率（Y）的變化，而超聲功率對多糖得率（Y）的影響相對不明顯。響應曲面的坡度的陡峭程度說明隨著影響因素的變化，其對應響應值的變化情況。而等高線的形狀可反映出交互效應的強弱，橢圓形表示兩因素交互作用顯著，而圓形則與之相反［8］。

由圖5可知，響應曲面陡峭，表明料液比和超聲時間的交互作用對香菇多糖得率影響較大。從等高線形狀可以看出，超聲時間對多糖得率的影響要大于料液比。

由圖6可知，響應曲面較陡峭，表明超聲波功率和超聲時間的交互作用對香菇多糖得率影響較大。從等高線形狀可看出，超聲時間對多糖得率的影響要大于超聲波功率。

由圖7可知，響應曲面也較陡峭，表明超聲波功率和超聲時間的交互作用對香菇多糖得率影響也較大。從等高線形狀可看出，料液比對多糖得率的影響要大于超聲波功率。

綜上所述，超聲時間對香菇多糖得率的影響最大；其次是料液比和超聲波功率［9］。

圖5 料液比和超聲時間的相互影響及等高線分析圖

圖6 超聲波功率和超聲時間的相互影響及等高線分析圖

圖7 超聲波功率和料液比的相互影響及等高線分析圖

2.2.4 優(yōu)化提取參數(shù)和驗證模型 通過響應面試驗分析，確定超聲波輔助提取法提取香菇多糖最佳因素水平為：超聲時間25 min，料液比1∶30，超聲功率300 W，香菇多糖得率的最大預測值為25.55%。在上述條件下，進行3組驗證性試驗，結(jié)果見表4。

表4 超聲波提取法的驗證試驗結(jié)果

經(jīng)驗證，實測值與預測值之間擬合較好，誤差在允許范圍內(nèi)，說明利用響應面法對熱水浸提法和超聲提取法提取香菇多糖的結(jié)果分析是可行、有效的［10］。

2.3 超聲波輔助提取法與傳統(tǒng)方法的比較

由單因素試驗和響應面優(yōu)化試驗結(jié)果可知，熱水浸提法提取香菇多糖的最佳工藝條件為：料液比1∶17.5、提取時間3 h、提取溫度80℃，在此條件基礎上，進行響應面優(yōu)化試驗，結(jié)果得香菇多糖得率為20.57%。超聲波輔助提取法與熱水浸提法提取香菇多糖的比較（表5）表明，超聲輔助提取法與傳統(tǒng)的熱水浸提法相比，香菇多糖得率具有明顯提高的同時，其提取時間和反應溫度均有減小，因此超聲波輔助提取法較傳統(tǒng)提取方法更有優(yōu)勢，既節(jié)約了原料，又減少了能耗。

表5 超聲輔助提取與傳統(tǒng)熱水浸提法的比較

3 討論

本研究首先考察了香菇多糖的單因素試驗，然后以香菇多糖得率為指標，對超聲提取過程中影響香菇多糖提取的超聲功率、超聲時間和液料比3個因素，采用中心組合（Box-Behnken）試驗設計及響應面分析，建立回歸模型。通過分析各因素的顯著性和交互作用，優(yōu)化得到香菇多糖超聲提取的最優(yōu)工藝參數(shù)。

單因素試驗中，多糖得率隨超聲功率、超聲時間、料液比和溫度的變化趨勢均為先升高然后下降。溫度的升高，有利于增加溶劑的滲透能力，加快香菇多糖從細胞向外擴散的速率，使得多糖得率升高。溫度過高，會破壞多糖的結(jié)構(gòu)影響其生物活性；同時高溫提取對工業(yè)化生產(chǎn)的設備也提出嚴格要求［11］；超聲功率的逐漸增大，多糖得率也隨之加大，這是因為超聲波的機械剪切作用加強，香菇粉末的細胞破壞更充分，有助于多糖從細胞中溶出。超聲功率在300-500 W間，多糖得率下降，主要因為當超聲功率大于300 W時，超聲作用進一步加速了提取液的流動，減少了物料在超聲場中的停留時間，破壁作用也就隨之減弱，同時超聲波的剪切作用也會在一定程度上破壞香菇多糖的結(jié)構(gòu)，從而影響多糖得率［12］；在一定時間內(nèi)，香菇多糖隨時間的延長而不斷被溶解出，超聲時間愈長，多糖得率越高。但擴散達到平衡后，超聲時間過長，香菇多糖得率反而降低，這是因為超聲波具有較強的機械剪切作用，長時間的作用會使大分子的多糖斷裂，從而損失增大而影響多糖得率［13］；隨著液料比的增大，香菇多糖得率增加，但當液料比超過一定范圍后，多糖得率增加的不再明顯。這是因為對于一定量的香菇粉末來說，溶劑用量的增加，增加了原料與溶劑接觸界面的濃度差，從而提高了香菇多糖與溶劑的擴散速度，多糖得率增大。溶劑量太多，顆粒細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)等物質(zhì)析出，降低了提取液的固形物含量，不利于以后的分離，且加重了工業(yè)生產(chǎn)中后續(xù)工藝［11］。

試驗結(jié)果表明，超聲波法的多糖得率高于傳統(tǒng)熱水浸提法，且超聲波提取法具有快速、節(jié)能、操作簡便、不改變香菇多糖原有性質(zhì)等優(yōu)點。尤其是提取時間可以縮短5倍，是工業(yè)生產(chǎn)中有價值的提取工藝。與以往香菇多糖提取的相關研究［14］相比，本試驗超聲輔助提取法提取香菇多糖的提取時間短，能耗小、提取劑用量少、香菇多糖得率高。

4 結(jié)論

通過Box-Behnken的中心組合設計及響應面（RSM）分析，建立超聲提取香菇多糖的二次多項式數(shù)學模型。經(jīng)檢驗證明該模型是合理可靠的，能夠較好地預測香菇多糖得率。利用模型的響應面及其等高線，對影響香菇多糖得率的關鍵因素及其相互作用進行探討，通過典型分析并考慮到實際操作的便利性得到的最佳工藝條件為：超聲時間25 min、料液比1∶30、超聲功率300 W，在此優(yōu)化條件下，香菇多糖得率的理論值為25.55%。為了進一步驗證響應面分析法的可靠性，采用上述最優(yōu)條件進行3次，測得超聲提取香菇多糖的驗證試驗，香菇多糖得率分別為：25.52%、25.92%和25.69%，其平均值為25.71%，與理論值（25.55%）相比，相對誤差較小，為0.63%。經(jīng)中心組合（Box-Behnken）試驗設計及響應面分析優(yōu)化后，多糖得率平均值比傳統(tǒng)法熱水浸提法提高了5%左右。

［1］Surenjav U， Zhang LN， Xu XJ. Effects of molecular structure on antitumor activities of（1→3）-β-d-glucans from different Lentinus Edodes［J］. Carbohydrate Polymers， 2006， 63（1）：97-104.

［2］呂國英， 范文法， 張作法， 潘慧娟. 香菇多糖研究進展［J］. 浙江農(nóng)業(yè)學報， 2009， 21（2）：183-188.

［3］胡斌杰， 陳金鋒， 王恭南. 超聲波法和熱水浸提法提取靈芝多糖的比較研究［J］. 食品工業(yè)科技， 2007， 28（2）：190-192.

［4］雒欣怡， 陳曉輝， 畢開順， 李偉. 響應面法優(yōu)化鹿銜草總黃酮的酶聯(lián)半仿生法提取工藝［J］. 中國實驗方劑學， 2013， 19（12）：19-21.

［5］肖衛(wèi)華， 韓魯佳， 楊增玲， 劉賢. 響應面法優(yōu)化黃芪黃酮提取工藝的研究［J］. 中國農(nóng)業(yè)大學學報， 2007， 12（5）：52-56.

［6］喬小瑞， 煙利亞， 劉興嵐， 熊何健. 荔枝殼多酚提取工藝的響應面法優(yōu)化及自由基清除活性研究［J］. 中國食品學報， 2010，10（5）：22-29.

［7］謝三都， 熊榮華. 響應面法優(yōu)化金銀花水溶性多糖提取工藝條件［J］. 農(nóng)產(chǎn)品加工（學刊）， 2013（1）：38-41.

［8］廖素鳳， 陳建雄， 黃志偉， 等. 響應曲面分析法優(yōu)化葡萄籽原花青素提取工藝的研究［J］. 熱帶作物學報， 2011， 32（3）：554-559.

［9］范曉良， 李行諾， 楚楚， 等. 響應面法優(yōu)化加壓溶劑萃取香菇多糖工藝研究［J］. 中國食品學報， 2012， 12（2）：98-103.

［10］王佰靈， 王淑美， 孟江， 等. 星點設計-效應面法優(yōu)化雞骨香揮發(fā)油提取工藝［J］. 中國實驗方劑學， 2014， 20（11）：37-41.

［11］燕航， 鐘耀廣. 影響香菇多糖提取的因素研究［J］. 現(xiàn)代食品科技， 2006， 22（2）：179-180.

［12］李萍， 孔明航. 超聲波協(xié)同纖維素酶提取山藥多糖的工藝及組分測定研究［J］. 農(nóng)產(chǎn)食品科技， 2009， 3（3）：24-28.

［13］魏海香， 梁寶東. 超聲波法提取珍珠香菇多糖的工藝研究［J］.食品研究與開發(fā)， 2012， 33（9）：49-52.

［14］朱俊訪， 李博. 香菇多糖提取的研究進展［J］. 中國民族民間醫(yī)藥， 2013， 22（1）：43.

（責任編輯 狄艷紅）

Optimization of Ultrasonic Assisted Extraction of Lentinan by Response Surface Methodology

Wan Yue1Qi Jiying1Zeng Hong1Han Yang2Han Jing1
（1. College of Pharmacy Engineering，Shenyang Pharmaceutical University，Shenyang 110016；2. College of Pharmacy，Liaoning University of Traditional Chinese Medicine，Shenyang 110032）

Technological conditions of extraction of Lentinan with ultrasonic extraction are optimized for developing and utilizing the resource of Mushrooms by using the response surface method（RSM）. Firstly， single factor experiment was investigated， and then based on single factor experiment， a 3-factor， 3-level Box-Benhnken experiment was designed， in which ultrasonic power， ultrasonic time and the ratio of solid to liquid were chosen as influencing factors， and the yield of polysaccharide was selected as response value. The result shown that the regression model fit well with experimental data， and it can well predict the polysaccharide yield of Lentinan. The optimum conditions of ultrasonic extraction were ultrasonic power of 300 W， ultrasonic extraction time of 25 min and solid-to liquid ratio of 1∶30， and the polysaccharide yield was 25.71%. Compared with the theoretical value（25.55%）， it has a smaller relative error at 0.63%. Compared with traditional method， ultrasonic extraction method is more efficient and less time consuming， so it is the ideal extraction method of Lentinan.

hot water extraction；ultrasonic assisted extraction method；polysaccharide yield；response surface optimization；single factor experiment

2014-06-11

萬閱，女，碩士，研究方向：天然產(chǎn)物分離純化及制劑；E-mail：wanyue19890830@126.com

韓靜，博士，教授，碩士生導師，研究方向：制藥工程技術(shù)（納米、干燥、提取分離）的應用；E-mail：huagonglou314@163.com