茶樹芽葉紫化的生理生化分析及其關鍵酶基因的表達

周瓊瓊孫威江，2

（1. 福建農林大學園藝學院，福州 350002；2. 福建農林大學安溪茶學院，福州 350002）

茶樹芽葉紫化的生理生化分析及其關鍵酶基因的表達

周瓊瓊1孫威江1，2

（1. 福建農林大學園藝學院，福州 350002；2. 福建農林大學安溪茶學院，福州 350002）

從生理生化和分子水平方面比較了茶樹紫化芽葉與成熟綠色葉片的差異。結果表明，紫色幼嫩新梢中茶多酚、兒茶素總量、咖啡堿含量高于成熟綠色葉片，差異達到極顯著。光合色素中，成熟綠葉樣品中葉綠素及葉綠素a、b的含量、類胡蘿卜素的含量極顯著高于幼嫩紫葉樣品，花青素含量極顯著低于幼嫩紫葉；在研究的9個花青素合成途徑關鍵酶基因中，實時熒光定量PCR分析表明，PAL、C4H、CHS、CHI、F3H、F3'H、F3'5'H、DFR和ANS在幼嫩紫葉中均呈上調表達，從而促進花青素的合成，使芽葉呈現紫色。

茶樹；紫色葉片；理化分析；基因表達

DIO： 10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.01.013

植物色素包括類胡蘿卜素、葉綠素、花青素等，是影響植物色澤的重要生化成分，在植物的次生代謝和視覺吸引力方面發揮著重要作用［1］。花青素是一類廣泛存在于植物中的水溶性色素，屬類黃酮化合物，在植物中常以糖苷形式存在于植物細胞的液泡中。因植物細胞液泡不同的pH值條件，使花瓣、葉片或果實呈現出不同的顏色，pH＜7呈紅色，pH=7-8時呈紫色，pH＞10時呈藍色［2］。對于植物而言，花青素具有多種生理功能，如吸引昆蟲傳粉、避免紫外線傷害、抵御低溫和防治植物病害等方面起著重要作用；對于人類而言，花青素作為一種天然色素，具有安全、無毒、資源豐富的特性，已廣泛應用于食品、化妝品領域。

茶樹作為一種多年生常綠葉用經濟作物，芽葉的色澤與鮮葉的內含成分、鮮葉的適制性和成茶品質都有著密切的關系。茶樹鮮葉的細胞液呈弱酸性，故當芽葉花青素含量較高時會呈紫紅色［3］。紫色芽葉茶樹是一種特色的茶樹種質資源，在地方有性群體品種中占有很大比例。武夷山是福建省茶樹種質資源的寶庫，具有成百上千份珍貴優異的茶樹種質資源，其中武夷奇種C18-1是典型的代表，幼嫩時新梢為紫色，但隨著生長發育過程，茶樹葉片顏色從幼嫩的紫色轉為成熟時的綠色。茶樹幼嫩芽葉的紫化現象以及特異性的紫色茶樹品種被認為與花青素在葉片中的累積有關［4］。紫芽茶中花青素含量較正常芽葉高很多［5］，其形成和積累與茶樹生長發育狀態和環境條件密切相關，較強的光照和高溫能增加其含量，使茶樹芽葉呈紫紅色，同時也是由植物體內相關基因調控所決定的。在花青素合成的途徑中，直接編碼花青素苷生物合成途徑中的關鍵酶類有查爾酮合成酶（Chalcone synthase，CHS）、查爾酮異構酶（Chalcone isomerase，CHI）、黃烷酮3-羥化酶（Flavanone 3-hydroxylase，F3H）、二羥基黃酮醇還原酶（Dihydroflavonol 4-reductase，DFR）、花色素苷合成酶（Anthocyanin，ANS）以及類黃酮3-O-糖基轉移酶（Flavonoid 3-O-glucosyltransferase，UFGT）均屬于花青素生物合成酶。

本研究擬通過研究幼嫩葉片與成熟葉片之間的理化成分差異以及花青素合成過程中關鍵酶的基因表達情況，旨在為深入研究茶樹葉片顏色轉變提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料 樣品于2013年春采于福建省武夷山市茶葉研究所資源圃，分別采摘武夷奇種C18-1同一時期不同成熟度的茶樹葉片，即幼嫩紫色葉片與成熟綠色葉片，按照五點采樣法混合均勻后，迅速用液氮處理，置-80℃冰箱保存備用。

1.1.2 試劑與設備 表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG，純度＞99%）、表沒食子酸兒茶素（EGC，純度＞99%）、表兒茶素（EC，純度＞99%）、兒茶素（C，純度＞99%）、表兒茶素沒食子酸酯（ECG，純度＞99%）、咖啡堿（Caffeine，純度＞99%）、沒食子酸（GA）標樣購自美國Sigma公司；Waters2890高效液相色譜儀（美國Waters公司）、臺式高速冷凍離心機（AllegraTM21RC Centrifuge Beckman）、電泳儀（北京六一儀器廠DYY-10C型）、電泳槽（北京六一儀器廠DYC-20C）、凝膠成像系統（美國UVP Gel Doc-It）、PCR儀（德國Biometra公司）。

1.2 方法

1.2.1 茶多酚含量測定 采用福林酚（Folin-Ciocalten）比色法。參照GB/T 8313-2008。

1.2.2 兒茶素總量及組分、咖啡堿的測定 參照周瓊瓊等［6］測定樣品兒茶素組分及其總量以及咖啡堿的含量。

1.2.3 光合色素含量的測定 葉片分別用80%（V/ V）丙酮提取色素后，按Lichtenthaler［7］的方法測定葉片葉綠素（Chl）、葉綠素a（Chla）、葉綠素b（C-hlb）與類胡蘿卜素（Car）的含量。

1.2.4 花青素含量的測定 參照Pang［8］的方法提取花青素測定液。用紫外可見分光光度計測量530 nm和657 nm的吸光度（OD），根據公式計算總花青素苷含量（OD/g·FW），OD=OD530-0.25×OD657。

1.2.5 茶樹葉片總RNA的提取和cDNA的合成 本試驗參照多糖多酚植物總RNA提取試劑盒（天根生化科技（北京）有限公司）提取茶樹總RNA。cDNA第一鏈的合成參照RevertAidTMFirst-Strand cDNA Synthesis Kit（Thermoscientific，Rockford，IL 61101，United States）試劑盒說明書進行。

1.2.6 花青素苷合成關鍵基因的表達分析 根據GenBank已公布的茶樹花青苷合成關鍵酶基因的序列或同源基因的氨基酸保守序列和核苷酸序列，用Primer Premier 5.0設計相應的熒光定量PCR引物，以茶樹β-tubulin為內參基因（表1），按照SYBR?Premix Ex TaqTM（TaKaRa，Japan）試劑盒說明進行熒光定量PCR。采用2-ΔΔCt方法分析各關鍵酶基因的相對表達量及其標準差。每個樣品檢測設置3個重復，整個試驗重復3次。

2 結果

2.1 茶多酚含量分析

茶鮮葉中多酚類物質與茶樹的生長發育、新陳代謝和茶葉品質關系密切。多酚類物質主要集中于茶樹新梢的生長旺盛部分，不同伸育程度的茶葉中茶多酚含量存在明顯差異；不同色澤的茶鮮葉其化學成分的含量也是有差異的。圖1顯示，紫色幼嫩新梢中茶多酚含量高于成熟綠色葉片，差異達到極顯著。

表1 花青素合成關鍵酶基因及內參基因的引物序列

圖1 不同色澤的葉片中茶多酚含量

2.2 兒茶素總量及組分、咖啡堿含量分析

研究結果（表2）表明，兩個樣品的兒茶素組成中酯型兒茶素的含量均高于簡單兒茶素含量，含量最高的是EGCG，其次是EGC和ECG，C含量最低。兒茶素總量及組分在紫色幼嫩新梢和綠色成熟葉片中差異均達到了極顯著水平。咖啡堿在兩個樣品中差異也達到了極顯著水平。

表2 不同顏色的葉片中兒茶素總量及組分、咖啡堿含量

2.3 光合色素含量的分析

葉片是光合作用的主要器官，葉綠體是進行光合作用的主要細胞器，葉綠素是參與光合作用光能吸收、傳遞和轉化的重要色素。圖2顯示，成熟綠葉樣品中葉綠素及葉綠素a、b的含量（圖2-D、2-A、2-B）、類胡蘿卜素的含量（圖2-C）均高于幼嫩紫葉樣品，且差異達到了極顯著水平；而成熟綠葉樣品的葉綠素a/b（圖2-E）、類胡蘿卜素/葉綠素的比值（圖2-F）均低于幼嫩紫葉樣品，差異也達到了極顯著水平。

2.4 花青素含量的分析

圖3表明，不同色澤的茶葉樣品中花青素含量差異明顯。紫色幼嫩新梢中花青素含量高于成熟綠色葉片，差異達到極顯著。茶樹芽葉呈紫色是由其高含量的花青素組分引起的。

2.5 花青素合成關鍵酶基因的熒光定量分析

選取茶葉中已獲得的與花青素類物質代謝相關的9個結構因子PAL、C4H、CHS、CHI、F3H、F3'H、F3'5'H、DFR和ANS，對其在不同部位茶葉中的表達情況進行實時熒光定量分析，各目標基因在不同葉片中的相對表達量采用比較閾值法，即通過計算2-ΔΔCT來確定。結果（圖4）表明，在鮮葉不同發育時期，PAL、C4H、CHS、CHI、F3H、F3'H、F3'5'H、DFR和ANS基因的表達水平與兒茶素積累規律一致。在研究的9個花青素合成途徑關鍵酶基因中，上游基因PAL、C4H、CHI、F3'H、F3'5'H在幼嫩紫葉和成熟綠葉中表達水平呈極顯著差異，即在幼嫩紫葉中均呈上調表達，說明花青素生物合成的上游關鍵酶基因對幼嫩葉片中花青素合成過程中有重要作用。CHS、F3H、DFR基因的表達水平在幼嫩紫葉和成熟綠葉中表達水平差異不顯著，其原因有待進一步驗證。

圖2 不同色澤的葉片中光和色素的含量

圖3 不同色澤的葉片中花青素含量

3 討論

3.1 生化成分變化

茶樹新梢所含的生化成分是形成成茶品質的重要物質基礎，多酚類物質不僅是形成茶葉色香味的主要成分之一，也是茶葉發揮保健作用的重要功能性成分。本研究的結果是紫色幼嫩新梢中茶多酚含量高于成熟綠色葉片，這與劉富知［9］、周志高等［10］的研究結果一致，紅紫色芽葉較綠色芽葉含有較多的茶多酚。蕭力爭等［11］的研究結果也表明，同一品種，紫色芽葉中的兒茶素含量比正常芽葉高（除簡單兒茶素外）。茶樹芽葉呈紫色與芽葉中的花青素含量關系密切，研究表明紅紫芽茶樹品系芽葉的紅紫色是由其高含量的花青素組分引起的，且成正相關，隨著花青素含量的增加其芽葉的紅紫色加深［12］。

3.2 色素含量變化

花青素含量與茶樹生長發育階段及環境條件關系密切，光照強、氣溫高則有利于花青素的累積，紅紫色芽葉的形成便是花青素積累較多的標志。葉片中花青素的合成與其它光合色素有顯著的聯系。隨著葉片的成熟，葉片中的各種色素呈現出不同的消長變化。這與蔡麗等［13］的研究結果是一致的。葉綠素在弱光下合成的多，在強光下一部分葉綠素被破壞而由胡蘿卜素取而代之，因此這些葉片在遮蔭、光照不足的情況下是綠色的，在強光下變成紫色。幼嫩新梢中含有較高的花青素，可能是通過花青素吸收光子從而達到保護葉綠體的作用。有研究表明［14，15］，含有花青素成分的紫葉通常比綠葉吸收的綠光多，花青素通過攔截能量量子，保護尚不成熟的葉綠體使其發育成熟，幼嫩葉片中花青素的積累和植物耐光抑制呈正相關，從而使葉綠體發育成熟避免過量的光輻射造成干擾，也是植物本身對逆境環境的一種適應機制。

圖4 不同色澤的葉片中花青素合成途徑關鍵酶基因的實時定量表達分析

3.3 基因表達量變化

花青素代謝合成途徑涉及諸多因素，包括環境因素、信號轉導、關鍵酶基因的表達及轉錄因子的調控等。這些環境因子的作用及色素的合成都是通過基因表達來起作用的［16］。目前，已有一些結構基因和調節基因從多種植物的花、果皮等組織中被分離和克隆出來，其結構基因的表達和調控也有較深入的研究，主要集中于模式植物，如擬南芥［17］、矮牽牛花［18］、金魚草［19］等，對茶葉的研究較少。本研究對不同部位茶葉花青素合成相關結構基因的表達量進行了分析，結果表明同一株茶樹不同部位茶葉色澤的差異可能是由于基因表達豐度的強弱從而影響花青素含量，成熟綠葉中相關基因表達量雖減少，但仍有一定的表達量，原因可能是由于上游基因除了合成與花青素相關的酶以外，還參與了類黃酮生化途徑其它分支上有關物質，如黃酮類物質、兒茶素的合成等。夏濤［20］課題組利用Q-PCR分析，發現具有不同兒茶素含量的細胞系之間F3H、ANS、ANR、DFR基因表達水平差異較大，DFR是類黃酮途徑中花青素合成的關鍵酶，該酶可催化二氫黃酮醇轉變為相應的黃烷-3，4-二醇，即變為無色花色素，而后者又是花色素苷、兒茶素和原花色素形成的共同前體。在茶樹芽葉發育期間，DFR的表達與兒茶素和多酚類的積累密切相關，而成熟綠葉中茶多酚、兒茶素總量低于幼嫩紫葉，其相關基因是如何調控則需進一步分析。

4 結論

本研究從生理生化和分子水平方面比較了茶樹同一時期不同發育程度紫化芽葉與成熟綠色葉片的差異，結果表明紫色幼嫩新梢中茶多酚、兒茶素總量、咖啡堿含量高于成熟綠色葉片，差異達到極顯著；光合色素中，成熟綠葉樣品中葉綠素及葉綠素a、b的含量、類胡蘿卜素的含量極顯著高于幼嫩紫葉樣品，花青素含量極顯著低于幼嫩紫葉；在研究的9個花青素合成途徑關鍵酶基因中，實時熒光定量PCR分析表明，PAL、C4H、CHS、CHI、F3H、F3'H、F3'5'H、DFR和ANS在幼嫩紫葉中均呈上調表達，從而促進花青素的合成，使芽葉呈現紫色。

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（責任編輯 馬鑫）

Physiological and Biochemical Analysis of Young Shoot Purple-related and Gene Expression of Key Enzymes in Tea Plant（Camellia sinensis）

Zhou Qiongqiong1Sun Weijiang1，2
（1. College of Horticulture，Fujian Agriculture and Forestry University，Fuzhou 350002；2. Anxi Tea College，Fujian Agriculture and Forestry University，Fuzhou 350002）

The young purple shoots of tea plant（Camellia sinensis）were compared to mature green leaves based on the biochemical and molecular level. Results showed that the content of tea polyphenols，catechins，caffeine and anthocyanins in the tender purple leaves were significantly higher than those in mature green leaves，while the content of chlorophyll and chlorophyll a，b，carotenoids were significantly lower than those mature green leaves. Q-PCR analysis indicated that the key genes of PAL、C4H、CHS、CHI、F3H、F3'H、F3'5'H、DFR and ANS in the anthocyanin biosynthesis were up-regulated in the tender purple leaves，which may contribute to the synthesis of anthocyanins and the color of the young shoots.

tea plant；purple leaves；physical and chemical analysis；gene expression

2014-06-15

國家國際科技合作項目（2010DFB33030-4），國家“863”計劃項目（2013AA10260605）

周瓊瓊，女，博士研究生，研究方向：茶樹特異性種質資源、茶樹遺傳育種與分子生物學；E-mail：zqxy1223@qq.com

孫威江，男，博士，教授，研究方向：茶葉質量安全與茶葉品質化學、茶樹遺傳育種；E-mail：swj8103@126.com