甘蔗轉基因甘露糖篩選系統的建立

王文治 楊本鵬 蔡文偉 馮翠蓮 王俊剛 熊國如 張樹珍

（中國熱帶農業科學院甘蔗研究中心 中國熱帶農業科學院熱帶生物技術研究所 農業部熱帶作物生物學與遺傳資源利用重點實驗室，海口 571101）

甘蔗轉基因甘露糖篩選系統的建立

王文治 楊本鵬 蔡文偉 馮翠蓮 王俊剛 熊國如 張樹珍

（中國熱帶農業科學院甘蔗研究中心 中國熱帶農業科學院熱帶生物技術研究所 農業部熱帶作物生物學與遺傳資源利用重點實驗室，海口 571101）

以甘露糖作為篩選底物，對甘蔗品種新臺糖22號進行臨界篩選濃度測定，獲得愈傷組織的繼代、分化、生根的臨界篩選濃度。而后應用含有甘露糖篩選標記基因pmi及綠色熒光蛋白報告基因GFP的植物表達載體，通過農桿菌介導法對新臺糖22號的愈傷組織進行遺傳轉化。用所測定的臨界篩選濃度先后進行繼代、分化、生根篩選培養，獲得抗性植株。對獲得的抗性植株分別進行pmi基因和GFP基因的PCR檢測，以及GFP顯微鏡熒光檢測，結果證實已成功建立了高效的甘蔗轉基因甘露糖篩選系統。

甘蔗轉基因；甘露糖；pmi基因；GFP基因

以大腸桿菌磷酸甘露糖異構酶（Phosphomannose isomerase，PMI）基因為篩選標記的篩選系統，有別于編碼抗生素抗性蛋白的基因（如新霉素磷酸轉移酶基因、潮霉素磷酸轉移酶基因、氯霉素乙酰轉移酶基因）及編碼抗除草劑抗性蛋白的基因（如Bar基因）等常用的篩選系統，是一種正向篩選系統，生物安全性好，有很好的應用前景［1］。1967年Malca等［2］就發現了以甘露糖為碳源的培養基上植物細胞不能正常生長，這是由于甘露糖在己糖激酶的催化下轉化為6-磷酸甘露糖，6-磷酸甘露糖不僅不能被細胞進一步代謝利用，而且當積累到一定濃度時就會抑制磷酸葡萄糖異構酶的活性，阻礙了糖酵解途徑，對細胞的正常生長代謝起到了抑制作用。而在磷酸甘露糖異構酶（PMI）的催化下，6-磷酸甘露糖可以轉化為細胞可以代謝的6-磷酸果糖［3］。因此轉入含有pmi基因的植物細胞能在以甘露糖為碳源的培養基上正常生長，而非轉基因植物細胞由于無法利用甘露糖而被抑制生長。自1998年Joersbo等［4］在甜菜上建立了PMI/甘露糖（PMI/Mannose）轉基因篩選系統以來，該系統已經被應用于多種植物的遺傳轉化篩選。早期研究如Paola等［5］將其應用到水稻轉基因上，Negrotto等［6］將其應用到玉米轉基因上。目前，我國科研人員利用該篩選體系獲得轉基因植株的作物也很多，如水稻、棉花、番茄、辣椒、雪柑等，覆蓋的作物極其廣泛［7-12］。由此可見，作為一種新型的生物安全性較好的轉基因篩選標記，越來越受到關注。在甘蔗轉基因方面，Jain等［13］通過基因槍轟擊法，在甘蔗上應用PMI/Mannose篩選系統，獲得的轉化效率為7.4%。我國各個甘蔗研究所也開展了對PMI/Mannose篩選系統的研究，轉基因方法基本以基因槍為主，轉化效率較低，獲得的轉化株系較少［14］。本研究應用本研究室成熟的農桿菌介導甘蔗轉基因技術，建立高效的PMI/Mannose甘蔗轉基因篩選系統，旨在為今后對農桿菌介導的甘蔗轉基因甘露糖篩選系統的應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 品種、質粒和菌株 本研究所用的受體材料為甘蔗主栽品種新臺糖22號，含pmi篩選標記基因及GFP熒光蛋白報告基因的植物表達載體為本實驗室構建保存，轉化所用農桿菌菌株為EHA105。

1.1.2 培養基配方 ①胚性愈傷組織誘導培養基：MS+2，4-D 1 mg/L+蔗糖30 g/L+卡拉膠8 g/L，pH5.8；②胚狀體分化培養基：MS+6-BA 1 mg/L+KT 0.5 mg/L +蔗糖30 g/L+卡拉膠8 g/L，pH5.8；③生根誘導培養基：MS（大量元素減半，其它成分不變）+NAA 2 mg/L+蔗糖20 g/L+ 椰水100 mL/L+卡拉膠8 g/L+活性炭0.2 g/L，pH5.8。

MR培養基：1/5MS大量元素+MS其他成分+ 2，4-D 1 mg/L+10 mmol/L果糖+10 mmol/L葡萄糖+30 g/L葡萄糖（固體培養基加入卡拉膠8 g/L），pH5.3。

1.2 方法

1.2.1 甘蔗胚性愈傷組織的誘導 以田間生長良好的甘蔗頂端生長點處的幼葉組織為外植體，經酒精及升汞消毒、無菌水沖洗后，于無菌濾紙上吸干其表面的水分后，切成1 mm左右厚度的薄片接種于誘導培養基上，于避光條件下進行培養至誘導出愈傷組織。

1.2.2 甘蔗愈傷組織繼代、分化、生根的臨界篩選濃度測定 挑取誘導了20 d左右的甘蔗愈傷組織在0%、40%、45%、50%、55%、60%、65%和 70%的甘露糖濃度梯度的愈傷繼代培養基上繼代培養20 d后，以相同甘露糖濃度梯度的分化培養基上再分化生長15 d，觀察發芽率，測定愈傷繼代與分化的臨界篩選濃度。以0%、10%、15%、20%、25%、30%、35%和40%的甘露糖濃度的生根培養基對甘蔗小苗進行生根培養30 d，測定甘蔗小苗在生根階段的最適篩選濃度。

1.2.3 農桿菌侵染菌液的制備 通過凍融法將含有pmi篩選標記基因及GFP熒光蛋白報告基因的植物表達載體導入到農桿菌菌株EHA105中。將經PCR鑒定為陽性的農桿菌在含抗生素的YEP平板上劃線，挑取單菌落接種到5 mL YEP的液體培養基中，振蕩培養至對數生長期，于150 mL三角瓶中擴大培養，培養至OD為0.6左右，將菌液轉移到離心管中，5 000 r/min 離心5 min，棄上清，吸干殘液，用MR液體培養基重懸菌體，最后置于28℃，200 r/min激活2 h，誘導細菌Vir基因的表達，作為轉化材料的浸染液。

1.2.4 愈傷組織的轉化 挑取生長旺盛的愈傷組織于濾紙上吹干使其處于干縮狀態，于工程菌液中浸泡30 min后，濾去菌液，用濾紙吸干殘液，吹干，轉移到MR固體培養基上。共培養3-4 d后，轉移到含有甘露糖的繼代培養基上繼代篩選培養20 d后，轉移到含有甘露糖的分化培養基上分化篩選培養15 d。待愈傷長出1 cm左右的小苗后，轉移至含有甘露糖的生根培養基上生根篩選培養30 d。

1.2.5 抗性小苗分子檢測 當在抗性生根培養基上生長旺盛，濃綠的小苗生長至4-7 cm后，按編號剪取小苗葉片組織約10-20 mg左右，剪碎置于eppendorf管中，用CTAB法提取DNA。分別合成篩選標記基因pmi和報告基因GFP的特異性引物進行PCR擴增檢測，擴增時設置正負對照。并對植株擴增產物進行回收測序，檢測擴增目的條帶的準確性。最后統計篩選標記基因pmi和報告基因GFP的PCR檢測陽性率。

1.2.6 遺傳轉化篩選過程的綠色熒光顯微鏡檢測 愈傷組織經菌液浸泡侵染及共培養，并進行繼代篩選培養20 d后，挑取部分生長良好的抗性愈傷顆粒于熒光顯微鏡中檢測綠色熒光蛋白的表達。

當抗性愈傷組織進行分化篩選培養15 d左右后，挑取分化生長迅速，且葉片濃綠的小苗進行綠色熒光顯微鏡檢測。

當抗性小苗于生根培養基上生長到一定高度后，剪取小葉片，進行綠色熒光顯微鏡檢測。分析3個不同篩選階段綠色熒光蛋白的表達情況。

2 結果

2.1 愈傷誘導與分化生長的甘露糖臨界篩選濃度測試

愈傷誘導與分化生長的甘露糖篩選濃度測試結果（圖1）顯示，甘蔗外植體在甘露糖濃度為0%的對照培養基上誘導30 d后繼續分化生長15 d，愈傷生長良好，愈傷分化能力達100%。當甘露糖濃度加大到55%時，愈傷分化能力為20%。當甘露糖濃度為60%時，愈傷分化能力低于10%，基本失去了分化能力。當甘露糖濃度≥65%，愈傷組織100%失去分化能力。因此在進行遺傳轉化篩選時，甘露糖篩選濃度應為60%。

圖1 愈傷繼代生長與分化生長的甘露糖篩選濃度測試

2.2 甘蔗小苗生根階段甘露糖臨界篩選濃度測試

如圖2所示，甘蔗小苗在甘露糖為0%的對照生根培養基上生長正常，根系發達。在甘露糖濃度為10%和15%的生根培養基上，部分小苗依然能正常生長，但根系已不如對照發達。當甘露糖濃度加大到20%或20%以上時，小苗已經無法正常生長，大部分葉片發黃，部分依然為綠色的葉片也表現出扭曲狀，細小而無法伸長生長，根系更是明顯受到抑制。因此在遺傳轉化時，小苗的生根培養甘露糖篩選濃度應為20%。

2.3 遺傳轉化與篩選

甘蔗外植體經消毒切成薄片置于誘導培養基上培養20-30 d后，逐漸形成生長旺盛，分化能力極強的愈傷組織（圖3）。經菌液浸泡過后的愈傷組織，進行20 d的黑暗篩選培養后進行15 d的光照分化篩選培養，甘露糖的篩選濃度為60%。篩選結果（圖4）顯示，大部分愈傷組織停止生長且無法分化出小芽，而小部分愈傷組織依然能健康生長，且在光照條件下能迅速分化成苗。挑取健康分化的芽叢于生根培養基上生根培養，甘露糖篩選濃度為20%。經過黑暗篩選及分化篩選后能迅速分化出來的小芽在生根篩選培養基上80%左右都能快速生長，且根系發達，而小部分的小芽無法生長，或生長緩慢，葉片偏黃。圖5為快速生長的抗性植株，葉片濃綠健康。

2.4 抗性小苗的分子檢測

生根培養到適當高度以后，首先進行篩選標記基因pmi的PCR檢測。結果（圖6）顯示，所選的23株抗性植株中除4、5和6號外，其余20株均為陽性，陽性率為87%。同時對這23株抗性植株的熒光標記基因GFP進行PCR檢測。結果（圖7）顯示，23株抗性植株中17株為陽性，陽性率73.9%。與篩選標記基因pmi基因的PCR檢測相比，除4、5和6號抗性植株同為陰性外，11、21和22號也表現為陰性。說明在遺傳轉化的過程中，基因片段出現斷裂缺失現象，而因篩選過程是針對pmi基因進行篩選的，所以得到的抗性植株中pmi基因的陽性率高于GFP基因。

2.5 遺傳轉化篩選過程的綠色熒光顯微鏡檢測

對遺傳轉化過程中繼代、分化、生根3個篩選階段進行綠色熒光顯微鏡檢測。結果顯示，從繼代篩選培養中挑取的抗性愈傷組織，為不規則生長的胚性愈傷組織，不受甘露糖篩選的影響生長健康，熒光極強（圖8）；抗性愈傷組織分化篩選培養后分化出來的小苗展示的綠色熒光（圖9）；對生根培養后剪取的葉片組織進行綠色熒光的檢測（圖10），左側紅色葉片為非轉基因植株，而顯示綠色熒光的葉片為轉基因抗性植株。

圖2 小苗生根生長的甘露糖篩選濃度測試

圖3 愈傷組織誘導

圖4 篩選后的分化培養

圖5 篩選后的生根培養

圖6 篩選標記基因pmi的PCR檢測

圖7 熒光報告基因GFP的PCR檢測

圖8 熒光愈傷

3 討論

本研究在轉基因株系的分子檢測中出現了報告基因與篩選標記基因PCR檢測陽性率不一致的現象，經查閱相關文獻，推測為在遺傳轉化過程中出現DNA片段缺失的現象［15，16］。報告基因GFP和篩選標記基因pmi在同一個T-DNA區內，因在篩選過程中是針對篩選標記基因pmi進行篩選的，因而得到的抗性植株中pmi基因的陽性率高于GFP基因。在篩選的過程中愈傷組織的繼代篩選與分化篩選的甘露糖濃度大于生根篩選濃度，主要由于甘蔗根系對甘露糖的敏感性要大于愈傷組織，與其他人的報道基本一致。此外本研究能迅速建立起甘露糖篩選系統，除本實驗室已積累的研究經驗外，通過強啟動子啟動報告基因GFP，并在試驗過程輔助予熒光顯微鏡的實時觀察，也是本研究取得成功的一大因素。

圖9 熒光小苗

圖10 熒光葉片

甘蔗轉基因研究上利用甘露糖篩選的報道已經很多。國內報道的基本為基因槍介導的遺傳轉化方式，效率比起農桿菌介導法來說偏低很多，多次進行遺傳轉化依然只能獲得較少的轉基因株系［1］。本研究室通過長期的努力，農桿菌介導的甘蔗轉基因技術已經相當成熟，已經成功地應用在bar基因抗除草劑篩選系統上。而本研究將農桿菌介導法與甘露糖篩選進行良好的結合，轉化效率較高。單次轉化4 g愈傷組織就能獲得30個以上的轉基因株系。同時因為pmi甘露糖正向篩選系統有較好的生物安全性，因此本研究所建立的農桿菌介導的甘蔗轉基因甘露糖篩選系統有很好的應用前景。

4 結論

本研究通過對愈傷繼代、分化及生根生長的3個階段進行甘露糖臨界篩選濃度進行測試，最后確定甘蔗愈傷在繼代與分化階段的甘露糖篩選濃度為60%，而生根生長的篩選濃度為20%。而后通過含有pmi篩選標記基因及GFP綠色熒光蛋白基因的植物表達載體對甘蔗品種新臺糖22號愈傷組織進行遺傳轉化，以60%的甘露糖篩選濃度進行繼代與分化階段的篩選，以20%的甘露糖篩選濃度進行生根階段的篩選，最后獲得抗性植株。提取抗性植株的葉片DNA進行pmi篩選標記基因及GFP綠色熒光蛋白基因的PCR檢測。同時在篩選的過程中輔助予綠色熒光的顯微鏡檢測。結果均證明本研究可以準確獲得轉基因植株，同時證明本研究室成功建立起了高效的轉基因甘蔗甘露糖篩選系統。

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（責任編輯 馬鑫）

Establishment of Mannose Selection System in Sugarcane Transformation

Wang Wenzhi Yang Benpeng Cai Wenwei Feng Cuilian Wang Jungang Xiong Guoru Zhang Shuzhen
（Sugarcane Research Center of Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences，Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology of Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences，Key Laboratory of Biology and Genetic Resources of Tropical Crops Ministry of Agriculture，Haikou 571101）

In this research the killing curve of mannose was tested at the subculture，differentiation and rooting stages of sugarcane cultivar ROC22. Then the expression cassette containing a pmi selection marker gene and a GFP report gene was transformed into sugarcane embryonic callus by Agrobacterium-mediated method. Resistant plants were obtained after selection by Mannose. The PCR detection result and GFP microscope observation result both show that our lab had established a high efficiency PMI/Mannose selection system in sugarcane transformation.

sugarcane transgenic；mannose；pmi gene；GFP gene

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.01.014

2014-06-12

現代農業產業技術體系建設專項資金項目（CARS-20-2-5），Cry1Ac-2A-gna融合基因遺傳轉化甘蔗的研究項目（31101197，2012-2014）

王文治，男，碩士研究生，助理研究員，研究方向：甘蔗基因工程；E-mail：wangwenzhi@itbb.org.cn

張樹珍，女，博士，研究員，研究方向：甘蔗生物技術；E-mail：zhangshuzhen@itbb.org.cn