cryIAc基因在轉基因玉米中的遺傳規律及對抗蟲性影響

王建軍楊慧珍劉佼

（1.山西省農業科學院隰縣農業試驗站，隰縣 041300；2.山西省農業科學院作物科學研究所，太原 030031）

cryIAc基因在轉基因玉米中的遺傳規律及對抗蟲性影響

王建軍1楊慧珍2劉佼1

（1.山西省農業科學院隰縣農業試驗站，隰縣 041300；2.山西省農業科學院作物科學研究所，太原 030031）

旨在研究目的基因在轉基因植株和后代植株（株系）中的遺傳規律及其對轉化植株抗蟲性的影響。以花粉介導法將cryIAc基因導入玉米自交系‘鄭58’和‘昌7-2’，對轉化植株及其后代株系進行分子檢測和田間抗蟲鑒定。結果表明：（1）轉化‘鄭58’和‘昌7-2’，T1代分別獲得轉基因植株24和41個，轉化率高達20%以上；（2）轉基因T2代、雜交F2代及回交1代（B1）的分子檢測結果證明，外源基因的遺傳符合孟德爾的3∶1、3∶1和1∶1的遺傳分離規律；（3）連續多帶的分子檢測結果還表明，外源基因可穩定遺傳并有效表達，表達水平在9.8-14.3 ng/g葉片鮮重之間；（4）抗蟲鑒定結果顯示，在陰性對照全部感蟲情形下，轉基因純合株系仍表現出較高抗蟲活性；（5）此外，回交試驗結果還證明外源基因通過雜交可傳遞給下一代；（6）最終經篩選得到SZ003、SZ005、SC001、SC004和SC007五個高抗蟲轉基因株系。結果表明，花粉介導法是一種高效、快捷的轉化方法，cryIAc基因導入玉米自交系植株后賦予和提高了轉基因植株的抗蟲活性。

轉基因玉米；cryIAc基因；遺傳規律；抗蟲性

玉米（Zea mays L.）是我國重要的糧食、飼料作物。目前我國玉米生產的總體形勢是供不應求，加之在玉米生產中還存在許多影響玉米產量的因素，特別是蟲害對玉米生產的制約，使得玉米市場的供應壓力更加沉重。由于資源匱乏，常規育種也已無法滿足當前玉米生產對抗性品種的需求，因此應用轉基因技術，突破常規育種中物種間基因橫向交流的壁壘，擴大其可利用基因資源的范圍，是改良玉米自交系、創制玉米新的抗蟲品種、提高玉米產量、緩解市場壓力的一條新途徑。蘇云金芽胞桿菌（Bacillus thuringiensis，Bt）所產生的殺蟲晶體蛋白（insecticidal crystal protein，ICPs）恰好可引起昆蟲細胞膜穿孔，導致細胞腫脹破裂，以致昆蟲進食困難并死亡［1，2］。目前Bt 基因是植物基因工程及轉基因育種中應用最廣泛、最具應用前景的抗蟲基因。轉基因植株抗蟲性方面：國外，早在1990年美國孟山都公司和迪卡公司就用基因槍轟擊法獲得了能正常結實的抗蟲轉基因玉米［3，4］。Lauer等［5］研究發現，在玉米螟自然侵染和人工接種4次的條件下，轉Bt 毒蛋白基因玉米的產量不受玉米螟的影響，產量比非轉Bt 毒蛋白基因玉米增產10%以上，比生產上應用的適應性好的對照品種增產4%-8%。同樣研究還發現，在歐洲玉米螟中等偏重發生的情況下，雖轉Bt 毒蛋白基因玉米殺蟲效果同化學防治相當，但較非轉Bt 毒蛋白基因玉米卻增產10%［6，7］。國內，丁群星等［8］首次用子房注射法將Bt 毒蛋白基因導入玉米自交系；王國英等［9］用基因槍轟擊法將Bt毒蛋白基因轉入玉米愈傷組織和幼胚獲得再生轉基因植株；袁英等［10］采用基因槍法將蘇云金芽胞桿菌的殺蟲毒蛋白基因（cryIA）導入東北春玉米自交系鐵7922 的幼胚中，獲得了轉基因植株，經篩選最終得到一批抗玉米螟自交系。在目的基因遺傳規律研究方面：大量的轉基因研究表明，轉化的外源基因能夠整合到植物細胞基因組，整合后的外源基因遵循該細胞遺傳物質的復制和表達規律，T1或T2代呈常見的3∶1遺傳分離［3，11-17］，也有研究認為轉Bt 基因植株的測交后代抗蟲和感蟲植株的比例接近1∶1，符合孟德爾單顯性基因的遺傳規律［18，19］。而李余良等［20］則認為轉基因T1代植株PCR檢測證明Bt基因能夠穩定遺傳，基因分離符合1∶1的孟德爾遺傳規律［19］。此外，還有一些研究認為由于轉基因整合的方式和拷貝數不同，或者由于沉默、損傷或丟失導致不規則的遺傳［21-24］。上述關于轉基因植物抗蟲性研究，大多集中在對轉基因植物前幾代抗蟲性研究，而轉基因純合株系的抗蟲性表現即對轉化株系抗蟲性穩定性卻少見報道；關于Bt基因在轉化株系中的遺傳分離方式的研究主要是針對T1、T2代或回交后代的遺傳分離，很少有人將兩者結合起來進行系統的研究。總之，由于在各自試驗中所用材料不盡相同，轉化方法也各有區別、缺少連續而系統的試驗策略，故所得結論雖類同，但可比性較差。

因此，本研究以p3301UbiAc為供體質粒，采用花粉介導法［25］將cryIAc基因導入玉米自交系‘鄭58’和‘昌7-2’，通過多代PCR檢測、Southern雜交分析，在獲得轉基因植株的基礎上，加代分析，即對后代植株進行PCR檢測、Southern雜交分析、ELISA分析，直到獲得轉基因純合株系，并通過雜交和回交，分別對T2代、F1代和B1代材料進行PCR和ELISA分析，驗證其外源基因分離比，并在T5代進行田間抗蟲鑒定，旨在連續系統地研究目的基因在轉化植株及其后代株系中的遺傳規律和轉化植株純合系的抗蟲活性表現。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 以目前玉米制種上使用較廣泛的自交系‘鄭58’和‘昌7-2’為受體材料。材料為本研究室保存備用。

1.1.2 質粒 轉化用質粒為p3301UbiAc，含有cryIAc基因，啟動子為Ubi，終止子為nos，載體菌為農桿菌LBA4404。圖1是質粒p3301UbiAc的圖譜。載體由中國農業科學院作物科學研究所王國英教授提供。

1.2 方法

1.2.1 質粒DNA、植物DNA和可溶性蛋白質的提取 質粒DNA的提取方法參見《分子克隆》［26］，植物DNA采用CTAB法提取。提取的DNA用于PCR檢測和Southern雜交分析。植物可溶性蛋白提取方法參考楊文鵬等［27］的方法，提取的蛋白用于ELISA分析。

圖1 質粒p3301UbiAc圖譜

1.2.2 轉化方法 轉化方法采用花粉介導法［28］，略作改良，在加入質粒DNA前做第1次超聲波處理，加入質粒DNA后，做第2次超聲波處理，處理參數不變。在授粉前，花粉處理液中加入少量的硼酸（50 mg/L）、GA3（40 mg/L）以促進花粉在授粉后的萌發。授粉后套袋，秋季收獲T0代種子。

1.2.3 田間試驗安排 2009-2013年間完成本項目研究，所有田間試驗均在山西東陽基地或三亞南繁基地進行，每年兩季。所有分子檢測試驗均在本中心基因工程研究室進行。

T0代種子全部播種得到T1代植株，全部取樣做PCR擴增分析，對PCR檢測呈陽性結果的材料做Southern雜交分析和ELISA分析，以獲得轉基因植株；T1代PCR和Southern檢測呈陽性的植株全部套袋自交，收獲的種子來年全部播種得到T2代植株，每個株系種5行，每行留苗12株，全部取樣進行PCR檢測，每個株系隨機取樣5份進行ELISA分析，每個株系取5份PCR擴增結果陽性的材料進行Southern雜交分析；T3代為隨機選取T2代分子檢測結果呈陽性株系的植株，每個自交系選20株，每株種5行，每行留苗12株，全部取樣做PCR檢測，隨機選取PCR陽性結果的材料做Southern雜交和ELISA分析；T4代同T3代；以此類推直到獲得穩定遺傳的純合轉基因株系。本研究在T4代獲得了6個‘鄭58’轉基因純合株系和7個‘昌7-2’轉基因純合株系。

2011年冬，每個自交系隨機選取2份轉基因純合株系的種子赴三亞做雜交試驗，每份種1行，另外取4份非轉基因的‘鄭58’和‘昌7-2’種子（每個自交系2份），每份播種1行，每行10株（對應于1個純合株系），花期取轉基因純合株系植株花粉授粉于其對應的非轉基因植株上，套袋，并作標記，秋季收獲F1雜交種子。2012年春東陽基地播種得到F1代植株，每穗種子種6行，每行定苗時留10株（3次重復），F1代植株全部取樣，做PCR擴增分析，每系每個重復各隨機選取30份樣品做ELISA分析，確定雜交F1代的外源基因分離比；同時取適量雜交F1代種子和各自交系非轉基因對照種子分別播種，取陰性對照花粉分別授粉于各個自交系的F1代植株，得到B1代種子；2012年冬季赴海南播種B1代種子，5葉期取樣做PCR檢測和ELISA分析，確定B1代材料的分離比。

1.2.4 遺傳規律研究 T1代來自T0種子單粒播種，因此不存在遺傳分離問題，僅通過PCR擴增、Southern雜交分析和ELISA分析，觀察外源基因在轉化植株中的導入、整合和表達等遺傳現象；對T2代轉化植株做同樣的分子檢測，結果可用來確定T2代中外源基因的遺傳分離現象；獲得轉基因純合株系前各代的分子檢測結果可用來確定外源基因在轉化株系中的世代遺傳規律；對F2、B1代的分子檢測結果可用于分析外源基因能否通過雜交方式傳遞給后代植株以及外源基因在F2和B1代的遺傳規律。

1.2.5 抗蟲性鑒定 2012年將T4代純合株系種子播種得到的T5代材料作為抗蟲鑒定接蟲圃。各個自交系分別選取5份純合系種子播種，每份種子出苗后定苗60株，以非轉基因的相應自交系為對照，試驗設3次重復。為避免株系間以及環境的干擾，每個株系間都用遮蟲網分開，空中也用遮蟲網覆蓋。當玉米生長到9-10 片葉左右時，將孵化的玉米螟卵接在心葉中，每株接3個中等大小的卵塊。在玉米抽雄吐絲期調查玉米螟危害植株的葉片數、蟲孔大小及其數目；在成熟期調查莖桿中玉米螟的隧道長度，按照Armstrong等［6］采用的標準，把只有蛀孔沒有運動的隧道長度記為＜2.5 cm；另外每份材料隨機取樣10份并混合，提取其可溶性蛋白質，采用Bradford［29］的方法測定蛋白濃度，以陰性對照的光吸收值為0，測定目的基因表達的蛋白量，以探討轉基因植株抗蟲活性與其體內殺蟲蛋白表達量的相關性。

1.2.6 分子檢測 各代植株均在5葉期取新鮮幼嫩葉片作為樣品，按1.2.1方法提取植物DNA或可溶性蛋白質，以備進行分子檢測和分析。

1.2.6.1 PCR擴增 cryIAc基因引物序列：上游5'-CTGACCGTGACCGTGCTG-3'，下游5'-TGGTGCCGTAGGCGAACT-3'，引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。擴增體系：總體積20 μL，Taq酶購自TRANSGEN 生物技術公司。擴增反應：94℃預變性5 min；94℃變性30 s，60℃退火30s，72℃延伸30 s，30個循環；72℃延伸10 min。擴增產物于1%瓊脂糖凝膠上電泳分離，在SYN成像系統上觀察電泳結果并照相。試驗設質粒DNA陽性對照，陰性對照。

1.2.6.2 Southern雜交分析 以PCR擴增結果呈陽性的植株為材料，用核酸蛋白檢測儀測定待酶切DNA濃度，再經適當稀釋，使各總DNA 濃度大致相同。取質粒DNA 25 μg和陰性對照DNA 25 μg各1份，轉化植株DNA 25 μg若干份，植物DNA用Xba I內切酶37℃ 酶切16 h，質粒DNA用Hind Ⅲ內切酶酶切，酶切產物在0.8%瓊脂糖凝膠上電泳分離，然后采用毛細管轉移法轉移到尼龍膜上［26］。

以cry I Ac 基因的PCR 特異擴增產物為模板，采用隨機引物方法制備地高辛標記探針。預雜交、雜交和洗膜，均按Roche 公司的地高辛DNA 標記及檢測試劑盒提供的方法進行，最后在含有NBT 和BCIP 的染色液中顯色。

1.2.6.3 ELISA檢測 各代材料取樣數參見表1。ELISA 檢測按試劑盒（EnviroLogix，USA）說明書進行。

1.2.6.4 玉米不同生育期目的基因表達分析 T5代植株，每個自交系選取2個株系，每個株系所取樣品混合后提取總蛋白，取樣時期和取樣材料為：5葉期，取樣第5葉片；拔節期，取樣此時植株部分心葉葉片；抽雄期，取樣此時植株第3頂葉葉片葉尖；灌漿期，取樣第2頂葉葉片葉尖。分別提取蛋白質做ELISA分析，從而研究外源基因在轉化植株不同生育期的表達現象。

1.2.7 對數據的統計分析 用DPS數據軟件進行分析。

2 結果

2.1 轉化植株的獲得

花粉介導法收獲T0種子‘鄭58’129粒、‘昌7-2’153粒。來年播種‘鄭58’出苗118株，‘昌7-2’出苗143株。經PCR檢測呈陽性結果：‘鄭58’ 51個，‘昌7-2’83個，對PCR陽性結果植株的Southern雜交分析，呈陽性結果：‘鄭58’24個，‘昌7-2’41個，轉化率分別為20.3%和28.7%。對Southern雜交陽性結果植株的ELISA檢測，結果全為陽性。證明cryIAc基因已導入并整合到轉化植株的染色體組中，且外源基因得到表達。由此獲得轉化植株‘鄭58’24個，‘昌7-2’41個。以上分子檢測中，所有陰性對照的檢測結果均為陰性。

T4代部分轉化植株的PCR檢測結果（圖2）顯示，除陰性對照外，質粒和轉化植株都可看到期望大小的特異條帶，表明目的基因存在于T4代轉化植株中。同時證明T4代轉基因株系已擬視純合。結合T4代材料的Southern雜交分析結果以及其田間抗蟲表現，最終選擇得到轉基因純合株系。

圖2 T4代部分轉化植株的PCR檢測結果

圖3 T2代部分轉基因植株的Southern雜交分析結果

部分T2代轉化植株的Southern雜交結果（圖3）顯示，陰性對照（泳道1）無雜交條帶出現，陽性對照（P）和絕大部分轉化植株（泳道2，3，4，6，7）都有雜交條帶存在，證明目的基因已整合到轉化植株的染色體組中。泳道5沒有發現雜交信號，可能與基因分離或丟失有關。圖3中還可看到，絕大部分轉基因植株均有一條雜交信號條帶，證明目的基因皆以單拷貝、單位點方式插入并整合到轉基因植株的染色體上。其中，泳道2和4號植株有兩條雜交信號帶，可能與多拷貝數整合有關（被淘汰）。各代分子檢測結果，見表1。

表1 各代轉基因植株的分子檢測結果

2.2 遺傳規律研究結果

T1代樣品的PCR檢測和Southern雜交分析結果證明，cryIAc基因已導入轉基因植株并整合到轉基因植株的染色體組中，ELISA檢測結果表明外源基因在轉基因植株中得到表達。

T2代材料的PCR檢測，‘鄭58’材料的陽性結果數∶陰性結果數=2.61∶1（χ2=5.633 3），‘昌7-2’材料的陽性結果數∶陰性結果數=2.8∶1（χ2= 2.220 1）；ELISA檢測結果：‘鄭58’材料的陽性結果數∶陰性結果數=2.64∶1（χ2=0.400 0），‘昌7-2’材料的陽性結果數∶陰性結果數=2.66∶1（χ2= 0.588 8）。PCR檢測結果與ELISA分析結果接近一致，對分離比例進行χ2測驗，結果證明外源基因在T2代的遺傳分離符合3∶1 的孟德爾遺傳規律。上述χ2檢驗水平為P＞0.01。

T3代轉基因材料的分子檢測結果顯示，PCR檢測陽性結果率接近99%，Southern雜交和ELISA分析的陽性結果率均為100%。證明轉基因株系已趨于純合。

T4代的分子檢測結果全為陽性，通過4代篩選，最終得到‘鄭58’轉基因純合株系9個，‘昌7-2’轉基因純合株系8個。

B1代的PCR擴增結果為：‘鄭58’陽性結果數∶陰性結果數=1.05∶1（χ2=2.151 1），‘昌7-2’陽性結果數∶陰性結果數=1.09∶1（χ2=0.257 8），ELISA檢測結果為：‘鄭58’陽性結果數：陰性結果數=1.05∶1（χ2=0.044 4），‘昌7-2’ 陽性結果數∶陰性結果數=1.14∶1（χ2=0.400 0）。χ2測驗，結果證明外源基因在F1代的分配符合1∶1 的孟德爾遺傳規律。同時，F2代植株中檢測到目的基因，證明轉基因可以通過雜交方式傳遞給期望的玉米自交系。同樣，F2代呈現出明顯的3∶1分離現象（PCR：χ2=5.305 9和 χ2=0.963 2，ELISA：χ2=0.088 9和χ2=0.355 5，P＞0.05）。

總體來講，轉cryIAc基因玉米植株及其后代株系中，目的基因均表現出孟德爾的單顯性基因的遺傳分離規律。

T5代轉基因植株的ELISA分析結果證明，在玉米生長的5葉期、撥節期、抽雄期和灌漿期，cryIAc基因均能正常表達，意味著在轉基因的玉米株系的大部分生長發育階段，均能在一定程度上減少殺蟲劑的使用或不用。

本研究從橫向、縱向分別對轉基因植株（株系）中目的基因的遺傳方式和表達現象進行了分析。均未發現cryIAc基因的基因沉默現象。

2.3 轉化植株的抗蟲鑒定結果

田間抗蟲鑒定轉基因植株的蛋白質濃度測定結果（表2）顯示，T5代轉基因植株中目的基因的表達量介于9.8-14.3 ng/g葉片鮮重之間，占植株總可溶蛋白量的0.1%左右。抗蟲調查結果（表3）顯示，陰性對照株系的玉米螟食葉危害的程度比轉基因株系大，即兩個自交系的陰性對照材料全部感蟲，且單株蟲孔葉片數多、蟲孔也大，害蟲的莖稈隧道長度為5.7-14.6 cm。圖4顯示轉基因株系的受損植株數和單株受損葉片數均比陰性對照低得多，而且受害葉片的受損程度也比對照低。證明目的基因的導入賦予和提高了轉化植株的抗蟲活性，不同的轉基因株系間感蟲程度和蟲害程度以及各重復間雖有差異，但差異不顯著，而且轉基因株系的莖稈隧道長度均＜2.5 cm，證明在純合株系T5代時轉基因株系的抗蟲活性基本穩定。這與張紅偉等［30］認為高代轉基因株系植株的田間食葉級別均較小的結論基本一致。

表2 T5代轉基因植株中外源基因的表達量測定好結果

表3 轉基因株系抗玉米螟鑒定調查和分析結果

在玉米成熟期，莖桿中玉米螟的隧道長度可反映玉米材料對玉米螟抗性的強弱［31，32］。本研究同樣證明，轉基因株系的玉米螟莖稈隧道長度＜2.5 cm，表現出比陰性對照株系高抗蟲的特性。以上結果證明，在玉米轉基因純合株系中，抗蟲活性基本穩定。

結合轉基因純合株系植株中目的基因表達量與其抗蟲活性的相關性分析，轉基因植株中目的基因表達量與其自身的抗蟲活性呈顯著相關（R2=0.821，P＜0.01）。最終經認真篩選，本研究最后得到5個高抗蟲的轉基因出合株系，分別為SZ003、SZ005、SC001、SC004和SC007。

3 討論

轉cryIAc基因玉米自交系中，外源基因的遺傳分析表明，外源基因多以單拷貝、單位點形式整合到轉基因植株的染色體組中，而且可以有效表達和穩定遺傳，T2代和F2代的遺傳分離研究結果證明符合孟德爾單因子顯性遺傳分離規律，與朱常香等［33］的研究結論一致。轉基因株系的回交試驗結果顯示，外源基因的分離比為1∶1，與朱衛紅等［18］結果相近。不同生育期材料的ELISA分析結果表明，在玉米生長期間的大部分階段，外源基因都能以較高的水平表達，這對害蟲的防治是非常有益的。本研究分別依據T2代、F1代和B1代植株的檢測結果，證明目的基因遵循孟德爾單顯性因子的遺傳分離規律。

抗蟲性鑒定表明，相對于陰性對照，轉基因株系的抗蟲能力都有很大提升。但是不同轉基因植株或株系之間，殺蟲活力還是存在一定的差異，除了這些轉化體中存在個體差異外，還與外源基因在轉化植株中的表達量、整合拷貝數、位點等有關、甚至與基因的沉默或丟失或修飾也有關，表達量越高，抗性也越強［34，35］。關于抗蟲轉基因作物選育過程，轉基因后代材料抗蟲能力的穩定性一直受到人們關注。郭東全等［36］在研究大豆的轉化植株及其后代抗蟲性中，經連續4代篩選，得到抗蟲性趨于穩定的轉化后代株系。本研究對轉基因純合株系的抗蟲性分析表明純合株系中除個體間略有差異外，株系間、株系內植株的抗蟲活性基本一致。這較先前報道中在研究轉基因前幾代中轉基因株系抗蟲活性時所得出的株系間差異較大的結論更接近現實，因為遺傳不穩定的轉基因株系是不可能釋放到田間的。

圖4 田間抗蟲試驗照片

玉米優良自交系很多，對這些自交系一一轉化不僅需要很多時間，而且還要耗費大量的人力、物力。能否通過雜交方式將外源基因傳遞到期望的自交系中，從而培育出優良自交系，用于創制優異性狀的玉米品種，是人們所期望的。有報道認為，無論用何種轉化方法，基因整合一旦發生，外源DNA 都有可能在減數分裂過程中保留下來，從而穩定地遺傳給后代［37］。本研究中T5轉基因植株與其對應非轉化自交系雜交得到含有目的基因的F1代，也證明了轉化體中的外源基因可通過雜交方式傳遞給下一代，這將為玉米新型抗性品種的創制提供技術保障。不過花粉與非轉基因自交系雜交結果還證明，花粉可攜帶導入的外源基因，這與前人研究所得的Bt基因能通過轉基因玉米的花粉大量傳送而發生轉移以及也能通過轉基因玉米的花粉飄落等多種形式進入土壤等結論［38-40］一致，再次證明Bt基因可能會飄逸造成基因污染；還有研究結果表明，鱗翅目、鞘翅目和雙翅目的多種昆蟲對生物制劑和轉基因植物均可產生抗性，鱗翅目昆蟲更容易產生抗性［41］，因此如何避免基因飄逸造成污染及其防止昆蟲對轉基因植株中殺蟲蛋白產生抗性等問題還需要進行深入的研究。此外，根據傳統理論，雜交F1代植株中的目的基因需要回交至少5代以上才能穩定，本研究中僅回交了1代，還需繼續開展這方面的工作。

許多植物的遺傳轉化體系都以抗生素或除草劑作為選擇標記基因，雖提高了獲得轉基因植物的效率，但隨著選擇過程的結束，這些外源選擇基因在植物基因組中的存在和表達就變得多余，可能會引發有關轉基因植物安全的許多問題［42］。本研究采用的花粉介導法轉化體系，無需冗長的組培過程，直接得到轉化種子，因此也無需這些標記基因的存在，在一定程度上會減少人們對轉基因食品和環境安全的擔憂。

本研究根據cryIAc基因的遺傳規律、表達水平以及田間抗蟲鑒定的研究分析，經篩選，得到5個高抗蟲的轉基因出合株系，分別為SZ003、SZ005、SC001、SC004和SC007。針對這5個株系材料，我們已申請了農業部的轉基因產品中間試驗，在進行中間試驗的同時，以轉基因材料作為親本，設計多個組合，觀察轉基因技術對轉化材料的配合力、農藝性狀等的影響，進而篩選出更適合生產上應用的轉基因新品新，為轉基因產品早日走向市場做好技術和物質準備。

4 結論

采用花粉介導法將cryIAc基因導入玉米自交系中，T4代獲得了轉化植株及轉基因純合株系，目的基因在轉化植株及其后代植株中能穩定遺傳和表達，表達量占總可溶蛋白的0.1%左右，而且目的基因表達量與植株的抗蟲活性間顯著相關。遺傳規律研究表明，轉基因材料在T2、雜交F2和回交B1代，外源基因的分離或分配比分別為3∶1、3∶1和1∶1。抗蟲鑒定結果證明，轉cryIAc基因的玉米植株獲得和增強了對玉米螟蟲害的抗性。經篩選，得到5個高抗蟲的轉基因純合株系，分別為SZ003、SZ005、SC001、SC004和SC007。

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（責任編輯 馬鑫）

Genetic Analysis of cryIAC Gene in Transgenic Maize Plants and Its Effects on Insect-resistance

Wang Jianjun1Yang Huizhen2Liu Jiao1
（1. Xixian Agricultural Experiment Stations，Shanxi Academy of Agricultural Sciences，Xixian 041300；2. Crop Science Institute，Shanxi Academy of Agricultural Sciences，Taiyuan 030031）

In order to analyse the genetic regularity of target gene cryIAc in transgenic and their descendant plants（lines）， and to study the effect of target gene on insect-resistant activity of transgenic plants at the same time， this research work was conducted. Firstly， cryIAc gene was transformed into maize inbred ‘Zheng 58’ and ‘Chang7-2’ separately by pollen-mediated transformation method. PCR， Southern，ELISA analysis and bioassay in the field of each generation transgenic plants were then conducted according to experimental requirements. Results showed that ⑴ A total of 24 and 41 transgenic plants were obtained through transformed cryIAc gene into maize inbred ‘Zheng 58’and ‘Chang7-2’， respectively. ⑵ The molecular detection results of transgenic T2， hybridization F2and backcross B1plants suggested that the segregation of target gene in these lines followed 3∶1， 3∶1 and 1∶1 segregation ratio of the Mendel laws of heredity， respectively. ⑶ The molecular detection results of T1to T4transgenic plants（lines）showed that the target gene could stably inherited and expressed effectively， the expression amount of the target gene was from 9.8 to 14.3 ng/g leaf fresh weight. ⑷ Moreover， the results of bioassay in the field indicated that in the case of high insect-susceptibility of negative control line， the transgenic lines still showed highly insect-resistant activity. ⑸ In addition， the target gene integrated into genomics of transgenic plants could inherit to the next generation plants by hybridization. ⑹ At last， 5 high insectresistant transgenic lines， SZ003， SZ005， SC001， SC004 and SC007， was gained by screening. The pollen-mediated transformation method was a effective and shortcut tool used in plant transformation， cryIAc gene could confer and enhance insect-resistant activity of transgenic plants（lines）tansfomated with it.

transgenic maize；cryIAc gene；genetic regularity；insect-resistance

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.01.019

2014-05-21

山西省科技攻關項目（20140311002-1），山西省農科院院育種高產項目（11yzgc064）

王建軍，研究方向：玉米育種和栽培；E-mail：wangjianjun1123@126.com