綠色木霉TvALP-linker-TvRBL融合基因的構建與原核表達

徐楊玉溫世杰李海芬李玲梁炫強

（1.廣東省農業科學院作物研究所，廣州 510640；2.華南師范大學生命科學學院，廣州 510631）

綠色木霉TvALP-linker-TvRBL融合基因的構建與原核表達

徐楊玉1，2溫世杰1李海芬1李玲2梁炫強1

（1.廣東省農業科學院作物研究所，廣州 510640；2.華南師范大學生命科學學院，廣州 510631）

在TvALP基因和TvRBL基因間加入一段柔性鏈接頭（linker）基因序列，構建融合基因。生物信息學分析表明該融合基因含有一段信號肽序列。利用RT-PCR技術從綠色木霉菌絲體總RNA中擴增出TvRBL基因、TvALP基因和去除信號肽的ΔTvALP基因，分別克隆到原核表達載體pET30a，構建重組質粒pET30a-TvALP-linker-TvRBL和pET30a-ΔTvALP-linker-TvRBL，轉化大腸桿菌BL21（DE3）pLysS，經異丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）誘導表達。SDS-PAGE電泳分析結果表明，去除信號肽的表達質粒pET30a-ΔTvALP-linker-TvRBL在大腸桿菌BL21（DE3）pLysS中獲得了表達，在60 kD處有一條蛋白質特異條帶，與預測的目的產物蛋白條帶大小一致。

綠色木霉；TvALP-linker-TvRBL融合基因；信號肽；原核表達

生物防治黃曲霉毒素污染是目前國內外研究的熱點、難點。綠色木霉是重要的生物防治菌，在植病生防中具有重要的作用。它的作用機制有以下幾種：（1）抗生作用；（2）重寄生作用；（3）溶菌作用；（4）競爭作用（主要為對生存空間和營養的競爭）；（5）誘導植物抗性；（6）協同拮抗作用；（7）毒性蛋白。

綠色木霉中的蓖麻毒素-B-凝集素（TvRBL）和堿性蛋白酶（TvALP）在植病生防中的作用機制分別屬于毒性蛋白和重寄生作用，其中重寄生作用是主要的防治機制。堿性蛋白酶可以降解植物病原真菌細胞壁，從而抑制病原菌的孢子萌發，并引起菌絲和孢子的崩解，以達到殺滅病原真菌的目的［1-4］。1978 年Rodriguez-Kabana發現蛋白酶活性與綠色木霉（T. viride）防治白絹病（S. rotlfsii）的能力有關［5］。而蓖麻毒蛋白-B-凝集素最早在傘菌中發現具有血凝活性［6］，其細胞凝集作用機制是凝集素分子的一個亞基與一個細胞表面的凝集素專一識別的糖基結合，另一個亞基與另一個細胞上的糖基結合，從而通過凝集素的“架橋”作用而導致的［7］。1994年Pemberton［8］發現他所研究的400余種大型真菌中，50%具有很強的凝集素活性。

本研究前期成功克隆了綠色木霉TvRBL和TvALP兩個基因，并在大腸桿菌中誘導表達，TvRBL蛋白為可溶性表達；而TvALP蛋白形成了包涵體，復性不成功，無法研究對黃曲霉的作用機理，因此獲得有活性的堿性蛋白酶對生物防治黃曲霉意義重大。目前，構建融合蛋白已經成為一種行之有效的方法來增加可溶性蛋白的表達和方便蛋白的純化［9，10］。其方法之一是通過連接肽序列將功能分子連接起來。本研究通過添加5個中性氨基酸的柔性多肽序列將TvRBL基因連接到TvALP基因的下游，構建pET30a-TvALP-linker-TvRBL以及切除信號肽的pET30a-ΔTvALP-linker-TvRBL原核表達載體，切除信號肽后獲得目的蛋白，旨在為進一步研究該融合蛋白的可溶性表達以及抗黃曲霉污染的分子機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與載體質粒 菌株綠色木霉（Trichoderma viride）由本實驗室前期獲得；黃曲霉（Aspergillus flavus L.）菌株GIM3.493引自中國科學院微生物研究所，該菌株侵染能力和產毒能力均較強；大腸桿菌DH5α、BL21（DE3）pLysS是本實驗室保存的菌種；載體有pUM-T Vector（Bioteke）、pET30a Vector（Novagen）。

1.1.2 試劑與工具酶盒 絲狀真菌RNA提取試劑盒、純化試劑盒購自Omega公司；各限制性內切酶、T4連接酶、DNA Marker、反轉錄試劑盒M-MLV RTase cDNA Synthesis Kit購自TaKaRa公司；PCR引物合成與測序由Invitrogen公司完成；BioTeke 2×Power Taq PCR Master Mix購Bioteke；蛋白Marker、Gel Extraction Kit均為TIANGEN公司的產品；質粒提取試劑盒購自Axygen公司；氨芐青霉素、卡那霉素、氯霉素等購自北京鼎國生物技術發展中心；SDS、Tris、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、β-巰基乙醇、考瑪斯亮藍R-250、TEMED、過硫酸胺、二硫蘇糖醇（DTT）等常用試劑均為國產分析純。

1.1.3 常用溶液及培養基 LB 液體培養基（g/L）：酵母膏5、胰蛋白胨10、NaCl 10，加過柱水，調pH值至 7.0，常壓滅菌20 min；LB 固體LB培養基在液體LB培養基基礎上加15 g瓊脂粉。

綠色木霉菌絲基礎培養基：Mandels營養鹽濃縮液100 mL，Mandels微量元素濃縮液1 mL，1 mol/L的檸檬酸緩沖液（pH4.5）50 mL，吐溫-80 2 mL，胰蛋白胨1.5 g，D-葡萄糖20 g，雙蒸水定容至1 L。PDA培養基：馬鈴薯200 g，蔗糖20 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 L。把馬鈴薯去皮后，切成1 cm3的小塊煮沸30 min，然后用紗布過濾，再加蔗糖和瓊脂，并補足水至1 L，混勻后分裝，115℃滅菌20 min，室溫保存。

50×TAE：242 g Tris，37.2 g Na2EDTA·2H2O，800 mL去離子水溶解，加入57.1 mL醋酸，混勻，去離子水定容至1 L，室溫保存備用。

常用抗生素：氯霉素用無水乙醇溶解，其余抗生素滅菌水溶解，0.22 μm濾膜過濾，分裝，-20℃保存備用。

1.2 方法

1.2.1 融合基因的生物信息學分析 根據實驗室前期克隆獲得的TvALP cDNA基因序列（GenBank登錄號：KJ659907）和TvRBL cDNA基因序列（GenBank登錄號：KJ659907），去除TvALP基因的終止密碼子和TvRBL基因的起始密碼子，中間用5個中性氨基酸的小型連接（GGCGGTGGCGGCAGC），將TvRBL基因連接到TvALP基因的下游，構建TvALP-linker-TvRBL融合基因（圖1）。生物信息學分析（圖2）表明，該融合基因前20個氨基酸為信號肽序列。

1.2.2 PCR引物與linker的設計 根據預測的融合基因序列，運用Primer 5軟件設計并合成特異性引物。擴增TvALP基因序列的引物為Tvalp；擴增ΔTvALP基因序列的引物為ΔTvalp；擴增TvRBL基因序列的引物為Tvrbl。具體的PCR引物序列見表1。

圖1 TvALP-linker-TvRBL融合基因

圖2 TvALP-linker-TvRBL融合基因信號肽的預測

表1 PCR引物設計

1.2.3 目的片段的擴增、PCR鑒定與測序 以綠色木霉菌絲體總RNA反轉錄得到的cDNA為模板，使用引物Tvalp、ΔTvalp及Tvrbl，分別擴增TvALP、ΔTvALP和TvRBL三個目的片段，PCR反應體系：2×PCR Master Mix 10 μL；引物各1.0 μL；模板為1.0 μL，加雙蒸水至總體積20 μL。PCR程序為：95℃預變性5 min；95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，35個循環；最后72℃延伸10 min。反應結束后，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。從瓊脂糖凝膠上切下含目的片段的凝膠，按照DNA凝膠回收試劑盒操作純化回收擴增產物。

回收純化后的目的片段與pUM-T質粒連接調制成10 μL，反應體系如下：pUM-T質粒1 μL，T4 DNA Ligase（3 U/μL）1 μL，2×T4 DNA Rapid Ligation Buffer 5 μL，目的片段3 μL，22-25℃反應10-30 min。取連接產物10 μL加入冰上融化的100 μL感受態細胞DH5α，混勻冰浴30 min；42℃熱激90 s，冰浴2 min。向離心管中加入500 μL 37℃預熱的（不含抗生素）LB培養基150 r/min、37℃振蕩培養60 min，使質粒上相關的抗性標記基因表達；取100 μL菌液涂布于含抗生素的篩選平板上，正面向上放置30 min，待菌液完全被培養基吸收后倒置培養皿，37 ℃培養過夜。

挑取LB平板培養基上的孤立菌落，以1 μL菌懸液為模板，PCR反應體系和程序同上，將預變性時間延長到15 min。反應結束后1%的瓊脂糖電泳檢測，挑選陽性克隆測序。測序正確的重組克隆質粒命名為pUM-T-TvALP、pUM-T-ΔTvALP及pUM-TTvRBL。

1.2.4 融合基因重組表達質粒的構建與鑒定 Kpn I和BamHⅠ雙酶切堿裂解法獲得的pUM-T-TvALP質粒、pUM-T-ΔTvALP質粒和pET30a載體，連接轉化大腸桿菌DH5α，挑取單克隆，37℃過夜搖菌，堿裂解法提質粒，進行PCR和雙酶切鑒定，測序鑒定正確的重組質粒命名為pE30a-TvALP和pE30a-ΔTvALP。

BamHⅠ和Hind Ⅲ雙酶切堿裂解法獲取的pUM-T-TvRBL重組質粒和鑒定正確的pET30a-TvALP、pET30a-ΔTvALP重組質粒，連接轉化BL21（DE3）pLysS菌株感受態細胞，涂布于含有終濃度50 μg/mL Kanamycn和34 μg/mL Chloromycetin的LB選擇性平板上，37℃培養，挑取單菌落，進行PCR鑒定。以構建好的重組質粒pET30a-TvALP-linker-TvRBL和pET30a-ΔTvALP-linker-TvRBL為 模板，用Tvalp、Tvalp-Tvrbl、Tvrbl、ΔTvalp、ΔTvalp-Tvrbl這5對引物分別進行PCR擴增，擴增產物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。用Kpn Ⅰ 和BamHⅠ、BamHⅠ和Hind Ⅲ、Kpn Ⅰ和Hind Ⅲ分別對兩個重組質粒進行雙酶切，酶切產物經1%的瓊脂糖電泳檢測。測序鑒定正確的重組質粒命名pET30a-TvALP-linker-TvRBL、pET30a-ΔTvALP-linker-TvRBL。

1.2.5 融合蛋白的誘導表達 提取質粒pET30a-TvALP-linker-TvRBL、pET30a-ΔTvALP-linker-TvRBL分別轉化大腸桿菌BL21（DE3）pLysS，分別挑取一個單克隆菌落接種于含有終濃度為50 μg/mL Kanamycn和34 μg/mL Chloromycetin 的5 mL LB液體培養基中，37℃培養過夜至對數生長期。次日按1%轉接擴大培養，當OD600達到0.6左右時，加入IPTG至終濃度為1 mmol/L，37℃進行化學誘導表達。每隔2 h取樣，繼續誘導6 h，同時以轉化有空載體pET30a的BL21（DE3）pLysS為陰性對照。分別離心收集細菌沉淀，每管加入400 μL蛋白上樣緩沖液，重懸后煮沸10 min，10 000×g離心10 min取上清液備用。

SDS-PAGE分析：配制12%分離膠和5%濃縮膠，取上述樣品，每孔30 μL，濃縮膠電壓90 V，分離膠電壓120 V，電泳結束后，參照康彬等［11］（2000）的方法，剝膠后用ddH2O沖洗數次，在考馬斯亮藍染色液中短暫振動染色20 min，然后用ddH2O反復沖洗后，浸入250 mmol/L KCl溶液中，直到背景清晰為止，整個過程大約需要1 h。暫時保存在保存液中或立即拍照觀察。

2 結果

2.1 目的片段的擴增

瓊脂糖凝膠電泳鑒定結果（圖3）表明，以綠色木霉菌絲體總RNA反轉錄得到的cDNA為模板，使用P1和P2、P1'和P2、P3和P4三對基因特異性引物，進行RT-PCR擴增，結果獲得 TvALP、ΔTvALP和TvRBL三個目的片段，大小約1 227、1 167及456 bp，與預期大小相符。

圖3 PCR產物的瓊脂糖凝膠電泳分析

2.2 重組克隆質粒的構建與鑒定

通過對pUM-T-TvALP、pUM-T-ΔTvALP和pUMT-TvRBL重組克隆質粒的菌液PCR鑒定，分別得到大小約1 227、1 167及456 bp的目的片段（圖4），結果均與預期值相符，視為擬陽性克隆，送華大測序，驗證正確后，表明目的基因均已插入載體質粒pUM-T多克隆位點。

圖4 重組克隆質粒的菌落PCR檢測

2.3 融合基因重組表達質粒的構建與鑒定

通過對重組質粒pET30a-TvALP和pET30a-ΔTv-ALP的Kpn Ⅰ 和BamH Ⅰ雙酶切鑒定、PCR鑒定，分別得到大小約5 382、1 227和1 167 bp的目的片段（圖5，圖6），結果均與預期值相符，證明質粒中含有目的片段，并且基因序列和閱讀框架均正確，表明已成功構建了pET30a-TvALP和pET30a-ΔTvALP載體。

圖5 重組表達質粒pET30a-TvALP（A）和pET30a-ΔTvALP（B）的PCR鑒定

圖6 重組表達質粒pET30a-TvALP（A）和pET30a-ΔTvALP（B）的雙酶切鑒定

通過對重組質粒pET30a-TvALP-linker-TvRBL和pET30a-ΔTvALP-linker-TvRBL的BamH Ⅰ和HindⅢ雙酶切和PCR鑒定，分別得到大小約為5 377、1 227、456、1 683、5 377、1 167、456和 1 623 bp的目的片段（圖7，圖8），結果均與預期值相符，證明兩個質粒中分別含有TvALP-linker-TvRBL以及ΔTvALP-linker-TvRBL融合基因，并且基因序列和閱讀框架均正確，表明已成功構建了TvALP-linker-TvRBL以及ΔTvALP-linker-TvRBL融合基因的表達載體。

圖7 重組表達質粒pET30a-TvALP-linker-TvRBL的PCR（A）和雙酶切（B）鑒定

圖8 重組表達質粒pET30a-ΔTvALP-linker-TvRBL的PCR（A）和雙酶切（B）鑒定

2.4 融合蛋白的誘導表達

含重組質粒pET30a-TvALP-linker-TvRBL的菌株未能誘導出蛋白，但含重組質粒pET30a-ΔTvALP-linker-TvRBL的菌株在60 kD處出現一條新生蛋白帶（圖9，圖10），與預測的融合蛋白大小相近，表明切除信號肽后可以誘導融合蛋白的表達。

圖9 TvALP-linker-TvRBL融合蛋白在大腸桿菌BL21（DE3）pLysS誘導表達的SDS-PAGE分析

圖10 ΔTvALP-linker-TvRBL融合蛋白在大腸桿菌BL21（DE3）pLysS誘導表達的SDS-PAGE分析

3 討論

本研究通過基因重組，組建了TvALP-linker-TvRBL及ΔTvALP-linker-TvRBL融合蛋白。融合蛋白中的兩個成分能否相互協同，發揮更好的生物活性，與二者能否分別形成正確的空間構象是密切相關的。目前，多數研究者采用低疏水性及低電荷效應的氨基酸組成的多肽接頭充分伸展以分開兩種組分，使它們能互不干擾地充分折疊成各自的天然構象。一般認為Linker的長度在5-25個氨基酸殘基為適，太短不能提供足夠的空間，較長對蛋白的折疊及穩定性有益，但容易受到蛋白酶的攻擊。含有Gly-Ser的連接肽是目前報道使用較多的連接肽之一，其中甘氨酸是分子量最小、側鏈最短的氨基酸，可增加側鏈的柔性；絲氨酸是親水性最強的氨基酸，可增加Linker的親水性［12-14］。

鐘丹丹等［15］通過添加10個中性氨基酸殘基的柔性肽基因序列將CD59和CD2兩類重要的淋巴細胞膜表面分子連接起來，成功構建了pIRES-CD59-linker-CD2融合基因真核表達系統。張明明等［16］添加19個中性氨基酸殘基TS-（G4S）3-AC的Linker編碼序列將心肌肌鈣蛋白I（cTnI）和肌鈣蛋白C（TnC）基因連接起來，成功構建了pET28a-cTnI-linker-TnC融合基因原核表達載體，并實現在大腸桿菌中可溶性表達。

為了保持融合蛋白的空間構型，本研究在兩個基因之間添加了5個中性氨基酸的“小型柔性肽”，技術關鍵在于利用了linker基因中間的ggatcc序列恰好是BamHⅠ酶切位點這一特性，把linker基因分成兩部分，分別放在TvALP和TvRBL基因的引物中，通過BamHⅠ酶切連接，成功拼接出了linker基因，篩選到了pET30a-TvALP-linker-TvRBL及pET30a-ΔTvALP-linker-TvRBL陽性重組質粒，并在E.coli BL21（DE3）pLysS宿主菌中得以表達，這與國內外一般采用合成單鏈，然后退火形成雙鏈DNA實現連接，或直接合成DNA后再連接的技術路線相比較，具有更容易篩選到陽性重組子的優點。

pET30a系列載體是目前應用最為廣泛的原核表達系統，已成功在大腸桿菌中表達了各種的異源蛋白［17，18］。本研究以pET30a質粒為表達載體，以E.coli BL21（DE3）pLysS為宿主表達菌，將TvALP-linker-TvRBL及切除信號肽的ΔTvALP-linker-TvRBL的融合基因分別克隆到原核表達載體，在相同條件下經IPTG誘導含重組質粒pET30a-TvALP-linker-TvRBL的菌株未誘導出蛋白，但含重組質粒pET30a-ΔTvALP-linker-TvRBL的菌株可以誘導融合蛋白的表達。原核生物翻譯過程的正確起始于mRNA 5'端的SD序列及其SD序列與起始密碼子之間的距離有關，30S亞基中16S rRNA必須與SD序列結合，才能使起始密碼子正確進入P位點，并形成復合物。因此，mRNA 5'端的二級結構是影響翻譯起始的一個重要因素，TvALP-linker-TvRBL信號肽的存在，使轉錄產物的5'端相對于去除信號肽的5'端形成復雜穩定的二級結構，從而影響到30S亞基與SD序列的識別與結合。

真核生物的信號肽在原核生物中進行表達時大部分不具有分泌功能，并且它始終與活性蛋白融合在一起，影響活性蛋白的正確折疊與功能發揮，需要在體外切除，因此，采用切除信號肽序列的ΔTvALP-linker-TvRBL基因在原核細胞中獲得了表達。該研究需要進一步探究該融合蛋白的可溶性，為下一步融合蛋白的純化，研究其抑制黃曲霉的分子作用機理奠定基礎。

4 結論

本研究通過添加5個中性氨基酸的柔性多肽序列（linker）將TvRBL基因融合到TvALP基因的下游，成功構建了pET30a-TvALP-linker-TvRBL原核表達載體以及切除信號肽的pET30a-ΔTvALP-linker-TvRBL原核表達載體，切除信號肽后獲得大小約60 kD的蛋白條帶。與預測的目的產物蛋白條帶大小一致。

［1］Szekeres A， Kredics L， Antal Z， et al. Isolation and characterization of protease overproducing mutants of Trichoderma harzianum［J］. FEMS Microbiology Letters， 2004， 233（2）：215-222.

［2］ Suárez MB， Vizcaíno JA， Llobell A， et al. Characterization of genes encoding novel peptidases in the biocontrol fungus Trichoderma harzianum CECT 2413 using the TrichoEST functional genomics approach［J］. Current Genetics， 2007， 51（5）：331-342.

［3］紀明山， 李博強， 陳捷， 等.綠色木霉TR-8菌株對尖鐮孢的拮抗機制［J］.中國生物防治， 2005， 21（2）：104-108.

［4］遲玉杰， 楊謙， 宋穎琦.對哈茨木霉轉化子菌體形態觀察及抗藥性測定［J］.哈爾濱工業大學學報， 2002， 34（6）：784-788.

［5］Rodriguez-Kabana R， Kelley WD， Curl EA. Proteolytic activity of Trichoderma viride in mixed culture with Sclerotium rolfsii in soil［J］. Canadian Journal of Microbiology， 1978， 24（4）：487-490.

［6］Guillot J， Konska G. Lectins in higher fungi［J］. Biochemical Systematics and Ecology， 1997， 25（3）：203-230.

［7］Hori K， Ogata T， Kamiya H， et al. Lectin-like compounds and lectin receptors in marine microalgae：hemagglutination and reactivity with purified lectins［J］. Journal of Phycology， 1996， 32（5）：783-790.

［8］Pemberton RT. Agglutinins（lectins）from some British higher fungi［J］. Mycological Research， 1994， 98（3）：277-290.

［9］Mao HY. A self-cleavable sortase fusion for one-step purification of free recombinant proteins［J］. Protein Expres Purif， 2004， 37（1）：253-263.

［10］Kim S， Lee YI. High-level expression and simple purification of recombinant human insulin-like growth factor I［J］. Journal of Biotechnology， 1996， 48（1）：97-105.

［11］康彬， 童哲.一種利于蛋白質回收的快速SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳染色-脫色方法［J］.生物化學與生物物理進展， 2000，27（2）：210-211.

［12］Wen Q， Ma L， Luo W， et al. Expression， purification， and refolding of recombinant fusion protein hIL-2/mGM-CSF［J］. Biomed Environ Sci， 2008， 21：509-513.

［13］Sakamoto S， Taura F， Putalum W， et al. Construction and expression of specificity-improved single-chain variable fragments against the bioactive naphthoquinone， plumbagin［J］. Biol Pharn Bull， 2009，32：434-439.

［14］Yan RQ， Wu ZM， Fang QM， et al. Reconstruction of a chicken BF2 protein complex and identification of binding nonamer peptides derived from avian influenza virus hemagglutinin［J］. Vet Immunol Immunopathal， 2008， 126：91-101.

［15］鐘丹丹， 高美華， 李偉偉， 等. CD59-linker-CD2 融合基因真核表達系統的構建［J］.醫學研究生學報， 2011， 24（1）：15-19.

［16］張明明， 洪理泉， 盧仁泉， 等. cTnI-linker-TnC融合蛋白基因的構建， 表達及鑒定［J］.現代檢驗醫學雜志， 2007， 22（1）：10-13.

［17］姜海霞， 劉永生， 楊孝樸， 等.人朊蛋白基因的克隆和原核表達［J］.甘肅農業大學學報， 2006， 41（3）：11-15.

［18］王曉東， 牟玉蓮， 張莉， 等.近交五指山小型豬SLA-DQA基因的克隆及在大腸桿菌的原核表達［J］.甘肅農業大學學報，2006， 41（4）：23-26.

（責任編輯 馬鑫）

Construction and Prokaryotic Expression of Trichoderma viride TvALP-linker-TvRBL Fusion Gene

Xu Yangyu1，2Wen Shijie1Li Haifen1Li Ling2Liang Xuanqiang1
（1. Crops Research Institute，Guangdong Academy of Agricultural Sciences，Guangzhou 510640；2. College of Life Science，South China Normal University，Guangzhou 510631）

Fusion gene were constructed by linking the TvALP and TvRBL genes with a flexible chain（linker）. Bioinformatics analysis showed that the fusion gene contained a signal peptide. The TvRBL、TvALP and ΔTvALP genes were cloned by RT-PCR from the total RNA of Trichoderma viride mycelium， which in turn were cloned into expression plasmid pET30a to construct prokaryotic expression plasmids pET30a-TvALP-linker-TvRBL and pET30a-ΔTvALP-linker-TvRBL， then these two expression plasmids were transformed into E.coli BL21（DE3）pLysS， and protein expression were induced by IPTG. SDS-PAGE was used to analyze the expression of the fusion protein. The result showed that expression plasmid pET30a-ΔTvALP-linker-TvRBL was obtained expression in E.coli BL21（DE3）pLysS， which was a specific band at about 60 kD in size and identical with the expected molecular weight of the fusion protein.

Trichoderma viride；TvALP-linker-TvRBL fusion gene；signal peptide；prokaryotic expression

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.01.020

2014-05-22

國家“863”計劃項目（2006AA10Z156），廣東省自然科學基金重點項目（07117967）

徐楊玉，男，碩士，研究方向：生物防治微生物學；E-mail：574301612@qq.com

梁炫強，男，博士后，研究員，研究方向：花生遺傳育種；E-mail：Liang804@yahoo.com