一株拮抗鏈霉菌的鑒定及其多相分類特征

焦林培金 黃運(yùn)紅 李素珍 龍中兒

（江西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，南昌 330022）

一株拮抗鏈霉菌的鑒定及其多相分類特征

焦林培金 黃運(yùn)紅 李素珍 龍中兒

（江西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，南昌 330022）

通過16S rRNA基因序列分析一株拮抗放線菌JXNU03的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，通過生理生化試驗(yàn)分析其生理生化特征，利用菌絲生長率法和杯碟法測定其拮抗活性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，放線菌JXNU03在高氏一號(hào)培養(yǎng)基上培養(yǎng)時(shí)，基內(nèi)菌絲發(fā)達(dá)，分支多且不斷裂，氣生菌絲發(fā)育良好，孢子絲直形或螺旋狀，孢子表面帶刺，細(xì)胞水解液中檢測到葡萄糖，未檢測出特征性糖，糖類型屬于C型，細(xì)胞壁氨基酸中含有L，L-DAP，屬于細(xì)胞壁Ⅰ型，16S rRNA基因序列與滅癌素鏈霉菌的同源性高達(dá)98%，其發(fā)酵液對革蘭氏陽性細(xì)菌、革蘭氏陰性細(xì)菌、酵母菌和霉菌等都具有較強(qiáng)的拮抗作用。因此放線菌JXNU03被鑒定為滅癌素鏈霉菌，記為滅癌素鏈霉菌JXNU03（Streptomyes gancidicus JXNU03），是一株對細(xì)菌、酵母菌和霉菌均有較強(qiáng)拮抗活性的鏈霉菌，具有潛在開發(fā)價(jià)值。

滅癌素鏈霉菌；系統(tǒng)發(fā)育；多相分類

抗生素的發(fā)現(xiàn)及開發(fā)利用，對保障人類健康、延長人類壽命、防治動(dòng)、植物病害等方面都做出了巨大的貢獻(xiàn)，并對生物學(xué)等基礎(chǔ)學(xué)科的發(fā)展產(chǎn)生重要的影響。然而，隨著抗生素的廣泛應(yīng)用，耐藥性問題也隨之產(chǎn)生［1］。研究、開發(fā)具有全新結(jié)構(gòu)或全新作用機(jī)制的新抗生素是克服細(xì)菌耐藥性的重要途徑之一，并受到各國政府及產(chǎn)、學(xué)、研各界關(guān)注，已成為研究的熱點(diǎn)［2-4］。

國內(nèi)外有關(guān)新抗生素的研發(fā)主要集中在三個(gè)方面，一是對已知抗生素的結(jié)構(gòu)進(jìn)行改造，通過對已知抗生素進(jìn)行化學(xué)修飾，采用全合成的手段獲得已知抗生素的結(jié)構(gòu)類似物，甚至全新結(jié)構(gòu)的抗生素，以克服細(xì)菌的耐藥現(xiàn)象［5-7］。二是抗生素篩選模型的創(chuàng)新，構(gòu)建基于抗生素作用機(jī)理及特定靶標(biāo)，特別是作用于全新靶標(biāo)的高通量篩選模型［8-13］。三是基于新的物種孕育新的基因，新的基因指導(dǎo)新型抗生素的生物合成，從各種特定環(huán)境中篩選新抗生素菌，不斷拓展產(chǎn)抗生素的微生物來源［14-15］。

本實(shí)驗(yàn)室從江西龍虎山風(fēng)景區(qū)的土壤樣品中篩選得到一株對細(xì)菌、酵母菌、霉菌均有拮抗活性的放線菌JXNU03，研究該菌的多相分類特征，旨在為抗生素產(chǎn)生菌的開發(fā)和利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

1.1.1.1 試驗(yàn)菌株 放線菌JXNU03，本實(shí)驗(yàn)室自行從龍虎山風(fēng)景區(qū)土壤樣品中分離獲得，保藏于4℃的高氏一號(hào)瓊脂斜面，中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏編號(hào)：CCTCC NO：M2014011。

1.1.1.2 拮抗靶菌 金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、白葡萄球菌（Staphylococcus cremoris）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、蘇云金桿菌（Bacillus thuringiensis）、大腸桿菌（Escherichia coli）、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）、福氏志賀菌（Shigella flexneri）、藤黃八疊球菌（Sarcina lutea）、傷寒沙門菌（Salmonella typhi）、釀酒酵母（Saccharomy-ces cerevisiae）、白色念珠菌（Candida albicans）、紅酵母（Rhodotorula glutinis）、桔青霉菌（Penicillium citrinum）、鮮綠青霉（Penicillium verrucosum）、黑曲霉（Aspergillus niger）、米根霉（Rhizopus oryzae）、高大毛霉（Mucor mucedo）、芝麻枯萎病菌（Fusarium oxysporum）、水稻紋枯病菌（Thanatephorus cucumeris）、小麥赤霉（Fusarium graminearumt）、辣椒根腐病菌（Fusarium vasinfectum）、油菜菌核菌（Sclerotinia libertiana）、小麥青枯菌（Ralstonia solanacearum）、疣孢青霉（Penicillium verrucosum），以上菌種均由江西師范大學(xué)微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室保藏于4℃的培養(yǎng)基斜面。

1.1.2 試劑 試驗(yàn)涉及的PCR材料購于大連寶生物有限公司，其他生化試劑均購于生工生物工程（上海）股份有限公司，其他化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基 種子培養(yǎng)基（g/L）：蔗糖22.5，黃豆餅粉12.5，NaCl 1，K2HPO40.2，Na2SO40.1，F(xiàn)eSO4· 7H2O 0.01，CaCO32，pH為7.2；發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：蔗糖45，黃豆餅粉25，NaCl 1，K2HPO40.2，Na2SO40.1，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01，CaCO33，pH為7.2；活性檢測上層培養(yǎng)基（真菌為靶菌）（g/L）：馬鈴薯200，葡萄糖20，瓊脂20，pH自然；活性檢測上層培養(yǎng)基（細(xì)菌為靶菌）（g/L）：牛肉膏3，蛋白胨10，葡萄糖5，NaCl 5，瓊脂15-20，pH7.0-7.2；活性檢測下層培養(yǎng)基：20 g瓊脂，加熱溶解于水后以蒸餾水定容至1 000 mL，121℃滅菌20 min。

1.2 方法

1.2.1 形態(tài)特征觀察 光學(xué)顯微鏡觀察：采用插片法［16］觀察菌株形態(tài)特征。即將菌株接種于高氏一號(hào)平板上，將滅菌的蓋玻片斜插入平板，并于28℃培養(yǎng)3、5、7、10、14和21 d，分別取出蓋玻片，用美藍(lán)簡單染色，在油鏡下觀察基內(nèi)菌絲、氣生菌絲、孢子絲形態(tài)特征。掃描電鏡觀察：將菌株接種到ISP2平板上插片培養(yǎng)14 d，取出插片，用HITACHI E-1045磁控濺射器噴金，然后用HITACHI S-3400N掃描電子顯微鏡掃描觀察菌株形態(tài)特征。

1.2.2 細(xì)胞化學(xué)組分分析 分析細(xì)胞壁氨基酸組分及全細(xì)胞水解物糖型，具體按文獻(xiàn)［18］的方法進(jìn)行。

1.2.3 系統(tǒng)發(fā)育分析 利用優(yōu)化SDS法提取菌體總DNA［17］，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測基因組DNA，采用細(xì)菌16S rRNA基因擴(kuò)增通用引物正向Pf：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'；反向Pr：5'-GGCTACCTTGTTACGACTT-3'進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系為25.0 μL，包括：5 U/μL TaKaRa LA Taq 0.5 μL，2×GC Buffer I 25 μL，2.5 mmol/L dNTP Mixt-ure各8 μL，10 μmol/L F27 2 μL，10 μmol/L R1492 2 μL，DNA模板1 μL，ddH2O 11.5 μL。PCR擴(kuò)增條件：94℃ 1 min；94℃ 30 s，57℃ 30 s，72℃ 1.5 min，共30個(gè)循環(huán)；72℃ 5 min。將PCR產(chǎn)物送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。根據(jù)測序結(jié)果，在NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行序列比對，使用MEGA5.0軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，用Neighbor-Joining的方法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，Bootstrap值參照。

1.2.4 培養(yǎng)特征分析 將JXNU03菌株分別接入ISP2-ISP5及高氏一號(hào)培養(yǎng)基中，分別于28℃恒溫箱培養(yǎng)7、14及21 d后取出觀察，記錄氣生菌絲、基內(nèi)菌絲及可溶性色素（培養(yǎng)基顏色），具體參見文獻(xiàn)［18，19］方法進(jìn)行。

1.2.5 生理生化特征分析 將JXNU03菌株分別接入酪氨酸培養(yǎng)基、明膠液化培養(yǎng)基、淀粉水解培養(yǎng)基、Tresner瓊脂培養(yǎng)基、硝酸鹽還原培養(yǎng)液、濾紙條培養(yǎng)液、牛奶凝固與胨化培養(yǎng)基及不同碳源基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，檢測其生理生化特征，具體參見文獻(xiàn)［18，19］方法進(jìn)行。

1.2.6 拮抗活性測定 用無菌打孔器在長有放線菌JXNU03單菌落的高氏一號(hào)營養(yǎng)瓊脂平板上打4個(gè)菌餅（直徑為5 mm）接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中。200 r/min、28℃條件下發(fā)酵培養(yǎng)5 d。發(fā)酵液于8 000 r/min條件下離心10 min，取上清，重復(fù)離心一次后，上清液于4℃保存，杯碟法測定其抗細(xì)菌、酵母菌活性［20，21］，菌絲生長速率抑制法測定其抗霉菌活性［22］，抑制率的計(jì)算方法如下［23］：

2 結(jié)果

2.1 形態(tài)特征

放線菌JXNU03在高氏一號(hào)培養(yǎng)基中生長良好，菌落由最初的白色到4 d后逐漸變成灰色或灰白色，菌落之間差異不大，表面呈粉絨狀突起，無明顯褶皺；基內(nèi)菌絲發(fā)達(dá)，分支多且不斷裂，氣生菌絲發(fā)育良好，孢子絲直形或螺旋狀，孢子表面帶刺，其形態(tài)見圖1。根據(jù)其形態(tài)特征可初步確定放線菌JXNU03屬于鏈霉菌屬放線菌。

圖1 放線菌JXNU03的孢子形態(tài)

2.2 細(xì)胞化學(xué)組分

對放線菌JXNU03全細(xì)胞糖型和氨基酸組分分析，結(jié)果表明，細(xì)胞水解液中檢測到葡萄糖，未檢測出特征性糖，糖類型屬于C型，細(xì)胞壁氨基酸中含有L，L-DAP，屬于細(xì)胞壁Ⅰ型。這一細(xì)胞化學(xué)成分特點(diǎn)進(jìn)一步證實(shí)了放線菌JXNU03屬于鏈霉菌屬放線菌的判斷。

2.3 系統(tǒng)發(fā)育分析

通過對菌株JXNU03的16S rRNA基因序列的擴(kuò)增和測序，獲得約1 434 bp的該基因序列（提交GenBank，獲得登錄號(hào)為KJ002642），該序列與GenBank中的序列對比，發(fā)現(xiàn)與其同源性較高的相關(guān)菌株均為鏈霉菌屬（Streptomyces）放線菌。選取其中相似度較高的幾株，利用MEGA5.0軟件，采用N-J法（重復(fù)度1 000）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2）。系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果表明，菌株JXNU03與滅癌素鏈霉菌NBRC 15412的16S rRNA基因序列同源性最高，達(dá)到98%。由此可將放線菌JXNU03鑒定為滅癌素鏈霉菌，記為滅癌素鏈霉菌JXNU03（Streptomyes gancidicus JXNU03）。

圖2 基于16S rRNA基因序列同源性的放線菌JXNU03 系統(tǒng)發(fā)育樹

2.4 培養(yǎng)特征

菌株JXNU03在5種培養(yǎng)基上，一定時(shí)間后觀察其氣生菌絲、基內(nèi)菌絲的生長及顏色變化情況，詳細(xì)培養(yǎng)特征見表1，顏色鑒定參考文獻(xiàn)［19，24］。

2.5 生理生化特征

菌株JXNU03能利用葡萄糖、阿拉伯糖、木糖、果糖、鼠李糖、甘露醇、肌醇和蔗糖，但不能利用棉子糖；其過氧化氫酶、淀粉酶、明膠液化、纖維素水解、淀粉水解、牛奶凝固和胨化試驗(yàn)均呈陽性，氧化酶、硝酸還原、H2S產(chǎn)生及黑色素產(chǎn)生試驗(yàn)均呈陰性（表2）。

表1 放線株JXNU03的培養(yǎng)特征

表2 放線菌JXNU03 的生理生化特征

按照阮繼生等［25］的放線菌分類教程中描述的滅癌素鏈霉菌不能利用蔗糖，硝酸鹽還原呈陽性的特征，而放線菌JXNU03能利用蔗糖作為唯一碳源，硝酸鹽還原為陰性。本研究報(bào)道的滅癌素鏈霉菌JXNU03與文獻(xiàn)報(bào)道的滅癌素鏈霉菌（S. gancidicus）在生理生化特征方面也存在差異，如鄭小偉等［26］獲得一株抑藻活性的滅癌素鏈霉菌（S. gancidicus），其硝酸鹽還原為陽性，但能利用蔗糖為唯一碳源。因此，將鏈霉菌JXNU03鑒定為滅癌素鏈霉菌，記為滅癌素鏈霉菌JXNU03（Streptomyces gancidicus JXNU03）。

表3 放線菌JXNU03的抗菌譜

2.6 拮抗活性及抗菌譜

放線菌JXNU03發(fā)酵液具有廣譜的抗菌活性，抗菌結(jié)果（表3）表明，放線菌JXNU03對革蘭氏陽性的金黃色葡萄球菌、白葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、蘇云金芽胞桿菌和革蘭氏陰性的大腸埃希氏菌、銅綠假單胞菌、福氏志賀菌、傷寒沙門氏菌等細(xì)菌均具有抗菌活性，同時(shí)對紅酵母、白色念珠菌、米根霉、鮮綠青霉、小麥青枯菌、小麥赤霉、油菜菌核菌、芝麻枯萎病菌和辣椒根腐病菌等真菌也表現(xiàn)出抗菌活性，而對釀酒酵母、黑曲霉、高大毛霉和疣孢青霉不具抗菌作用。放線菌JXNU03發(fā)酵液對金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑為44 mm（圖3），對米根霉的抑菌率達(dá)到57.68%（圖4），均表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗菌活性。

圖3 抗金黃色葡萄球菌結(jié)果

圖4 抗米根霉結(jié)果

3 討論

放線菌自發(fā)現(xiàn)至今已有百余年的歷史，其分類學(xué)也已從經(jīng)典分類或表觀分類發(fā)展到化學(xué)分類，又由化學(xué)分類發(fā)展到分子分類，以及當(dāng)今生物系統(tǒng)進(jìn)化的多相分類。本研究按照阮繼生等［25］的放線菌分類教程，根據(jù)放線菌的形態(tài)、細(xì)胞化學(xué)成分（細(xì)胞壁I 型，細(xì)胞水解液糖C型）確定放線菌JXNU03屬于鏈霉菌屬，然后依據(jù)其16S rRNA基因序列進(jìn)化關(guān)系進(jìn)一步確定其為鏈霉菌屬放線菌。再由于放線菌JXNU03與滅癌素鏈霉菌NBRC 15412的16S rRNA基因序列具有最大的序列同源性（98%），二者形態(tài)特征相近，菌落顏色及個(gè)體形態(tài)在不同培養(yǎng)基上差異不大，表面均呈粉絨狀凸起，孢子絲直至螺旋狀，孢子表面帶刺。在生理生化特性方面，放線菌JXNU03除了可以利用蔗糖作為唯一碳源，硝酸鹽還原陰性不同之外，其它能利用葡萄糖、阿拉伯糖、木糖、果糖、鼠李糖、甘露醇和肌醇作為唯一碳源且不能利用棉子糖等方面相同。因此，將鏈霉菌JXNU03鑒定為滅癌素鏈霉菌，記為滅癌素鏈霉菌JXNU03（Streptomyces gancidicus JXNU03）。

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，滅癌素鏈霉菌（S. gancidicus）的代謝產(chǎn)物具有多種生物活性，如鄭小偉等［26］篩選的一株滅癌素鏈霉菌（S. gancidicus）具有高效抑藻活性，陳杰等［27］篩選的一株滅癌素鏈霉菌則對馬鈴薯病原真菌具有較強(qiáng)抑菌作用，而本研究的滅癌素鏈霉菌JXNU03對G+細(xì)菌、G-細(xì)菌、酵母菌和絲狀真菌都表現(xiàn)出較強(qiáng)的拮抗作用，預(yù)示其可能產(chǎn)生多種抗生素，是一種重要的抗生素產(chǎn)生菌，具有重要的開發(fā)前景。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)室從江西龍虎山風(fēng)景區(qū)的土壤樣品中篩選獲得一株對革蘭氏陽性細(xì)菌、革蘭氏陰性細(xì)菌、酵母菌和霉菌等都具有拮抗作用的鏈霉菌。該菌株在高氏一號(hào)培養(yǎng)基上培養(yǎng)時(shí)，基內(nèi)菌絲發(fā)達(dá)，分支多且不斷裂，氣生菌絲發(fā)育良好，孢子絲直形或螺旋狀，孢子表面帶刺，細(xì)胞水解液中檢測到葡萄糖，未檢測出特征性糖，糖類型屬于C型，細(xì)胞壁氨基酸中含有L，L-DAP，屬于細(xì)胞壁Ⅰ型，16S rRNA基因序列與滅癌素鏈霉菌NBRC 15412的同源性高達(dá)98%。將放線菌JXNU03鑒定為滅癌素鏈霉菌，記為滅癌素鏈霉菌JXNU03（Streptomyces gancidicus JXNU03）。

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（責(zé)任編輯 馬鑫）

Identification and Polyphasic Taxonomy Character of a Strain of Streptomycete

Jiao Linpeijin Huang Yunhong Li Suzhen Long Zhonger
（College of Life Science，Jiangxi Normal University，Nanchang 330022）

To identify a strain of actinomycetes JXNU03 through the sequences of 16S rRNA gene. The physiological characteristics were acquired through physiological and biochemical experiments. The antagonistic activity was determined by plate assay and adopting mycelium growth rate method respectively. When the actinomycetes JXNU03 was cultured on Gause 1 medium， the vegetative hyphae were well developed and abundant without fracture， and the aerial hyphae were grown well with straight or spiral spore hypha. There were some thorns on the surface of spores. The glucose was detected in the whole cell hydrolysis， while not other dominant diagnostic sugars， and the L， L-DAP was detected in cell wall. The phylogenetic analysis showed that the level of 16S rRNA gene sequence similarity between the actinomycete JXNU03 and Streptomyes gancidicus NBRC 15412. The strain JXNU03 demonstrated a board spectrum of antagonistic activity against. The Gram-positive bacteria， the Gram-negative bacteria， yeasts and molds. The actinomycetes JXNU03 was identified as Streptomyes gancidicus， and termed Streptomyes gancidicus JXNU03. As its antagonistic activity against bacteria， yeast and filamentous fungi. The actinomycetes JXNU03 possessed an important prospect for antibiotics development.

Streptomyes gancidicus；phylogenesis；polyphasic taxonomy

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.01.021

2014-05-27

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31160029，31360018），江西省教育廳科技計(jì)劃項(xiàng)目（GJJ12181）

焦林培金，女，碩士研究生，研究方向：微生物學(xué)；E-mail：523213792@qq.com

龍中兒，男，博士，教授，研究方向：基礎(chǔ)和應(yīng)用微生物學(xué)；E-mail：longzhonger@163.com