海洋細菌 Agarivorans sp.HZ105的瓊膠降解酶系

林伯坤陸國永宋燕謝銳權陳鴻霖胡忠

（1. 汕頭大學醫學院，汕頭 515041；2. 汕頭大學理學院生物學系，汕頭 515063；3.汕頭市雅殼生物科技有限公司，汕頭 515041）

海洋細菌 Agarivorans sp.HZ105的瓊膠降解酶系

林伯坤1，2陸國永2宋燕2謝銳權3陳鴻霖1胡忠1，2

（1. 汕頭大學醫學院，汕頭 515041；2. 汕頭大學理學院生物學系，汕頭 515063；3.汕頭市雅殼生物科技有限公司，汕頭 515041）

通過克隆得到菌株Agarivorans sp. HZ105中3個瓊膠酶基因，長度分別為2 988 bp、1 437 bp和1 362 bp，分別編碼瓊膠酶HZ1、HZ3和HZ4，分別屬于糖苷水解酶GH50、GH118和GH16家族。將這些瓊膠酶基因與質粒pET-32（a）構建重組表達載體，轉化大腸桿菌BL21（DE3），實現了瓊膠酶基因的重組原核表達，制備了重組酶，研究了瓊膠酶的酶解產物。瓊膠酶HZ1降解瓊脂糖以及高聚合度新瓊寡糖（聚合度為8、10、12和14）得到新瓊二糖和新瓊四糖；瓊膠酶HZ3降解瓊脂糖的終產物是高聚合度新瓊寡糖；瓊膠酶HZ4降解瓊脂糖和高聚合度新瓊寡糖為新瓊四糖和新瓊六糖。因此推測菌株HZ105主要先用瓊膠酶HZ3和HZ4降解瓊脂糖為較高聚合度的新瓊寡糖，隨后這些寡糖被瓊膠酶HZ1和HZ2（課題組先前報道的另一個瓊膠酶）降解為低聚合度新瓊寡糖。首次研究報道了Agarivorans屬中能產生4個瓊膠酶的細菌菌株及其瓊膠降解酶系，豐富了有關細菌降解瓊膠酶體系及其中各瓊膠酶作用的研究和認識，也有利于菌株HZ105瓊膠酶的有效開發應用。

瓊膠酶；基因克隆；Agarivorans；酶系；降解產物

海洋來源的功能性低聚糖的研發正受到越來越多的重視。瓊膠是很多紅藻細胞壁的主要成分。瓊膠寡糖經大量試驗證實具有多種生物活性：可促進小鼠腸道有益菌群生長，有望作為益生元［1］；具有抗氧化能力［2］；抑制血管形成［3］；具有皮膚保濕和美白功能，也可作為化妝品添加劑［4］。瓊脂糖是瓊膠的主要成分，瓊膠酶（Agarase）是能夠降解瓊脂糖的水解酶，根據其作用方式不同，可以把瓊膠酶分為兩類：α-瓊膠酶和β-瓊膠酶。α-瓊膠酶裂解瓊脂糖的α，1-3糖苷鍵，生成瓊寡糖（agarooligosaccharides）系列；β-瓊膠酶裂解瓊脂糖的β，1-4糖苷鍵，生成新瓊寡糖（neoagarooligosaccharides，NA）系列。生產瓊膠寡糖是瓊膠酶的一個重要應用。

至今絕大多數研究報道的瓊膠酶都來自海洋細菌。其中Agarivorans屬細菌是重要的一類瓊膠降解細菌，目前該屬中已有多個菌株的瓊膠酶基因得到研究報道，包括菌株Agarivorans sp. JAMB-A11的瓊膠酶AgaA11［5］，菌株Agarivorans sp. JA-1的瓊膠酶AgaJA1［6］和AgaJA2［7］，菌株Agarivorans sp. LQ48的瓊膠酶AgaA［8］，菌株Agarivorans albus YKW-34的瓊膠酶AgaB34［9］，菌株Agarivorans sp. AG17的瓊膠酶AG17［10］，菌株Agarivorans sp. QM38的瓊膠酶AgaD01［11］等。但是這些報道都是單獨對其中一個瓊膠酶進行研究，而且Agarivorans屬的這些瓊膠酶存在基因序列和酶性質的多樣性。雖然目前已有比較多的瓊膠酶得到研究，少數產瓊膠酶細菌也已得到基因組測序，但這些產瓊膠酶細菌中，其瓊膠酶降解系統有被研究得很少，尤其是Agarivorans屬細菌。

高產瓊膠酶海洋細菌Agarivorans sp.HZ105由本課題組從廈門附近海域海底沉積物中篩選得到，并發現該菌株能產多個瓊膠酶［12］。本課題組前期已經研究了菌株HZ105中的一個瓊膠酶HZ2［13］，本文繼續研究該菌株的其他3個瓊膠酶，闡述菌株HZ105的瓊膠降解酶體系，以期豐富對細菌降解瓊膠的酶體系的研究和認識，促進對細菌降解瓊膠酶體系中各瓊膠酶作用的理解，也有利于菌株HZ105瓊膠酶的應用開發。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 培養基和試劑 LB培養基：10 g 胰蛋白胨，5 g 酵母提取物，10 g NaCl，加雙蒸水至1 000 mL，pH7.0，121℃/20 min高壓滅菌。3，5-二硝基水楊酸（DNS）試劑配方：1% DNS，0.2% 苯酚，0.05%亞硫酸鈉，1% NaOH。細菌總DNA提取試劑盒、DNA膠回收試劑盒和質粒提取試劑盒均購自廣州東盛生物公司。

1.1.2 菌株和載體 產瓊膠酶菌株Agarivorans sp.HZ105由本課題組從廈門附近海域海底沉積物中篩選得到?？寺『捅磉_宿主菌分別是大腸桿菌E.coli DH5α和BL21（DE3）。表達載體為pET-32a（+）。

表1 菌株HZ105瓊膠酶基因克隆表達引物

1.2 方法

1.2.1 基因克隆和表達載體構建 將菌株Agarivorans sp.HZ105培養于2216E液體培養基中，離心收集菌體，使用試劑盒提取細菌總DNA。使用表1的引物擴增菌株HZ105的3個瓊膠酶基因hz1、hz3和hz4。按照表1中限制性內切酶對引物進行切割，并連接經同樣酶切的表達載體pET-32a（+），連接產物轉化大腸桿菌E.coli DH5α。經驗證連接正確的重組載體轉化大腸桿菌表達宿主BL21（DE3），最后測序驗證瓊膠酶基因是否正確連接到載體上。

1.2.2 瓊膠酶基因的原核表達 將帶有重組表達載體的重組菌接種于LB液體培養基中，37℃，150 r/min培養至生長期加入終濃度為1 mmol/L的IPTG，隨后置于16℃繼續振蕩培養6 h以上。

1.2.3 重組瓊膠酶的制備 用SDS-PAGE檢測重組蛋白在大腸桿菌中的表達部位。對于在大腸桿菌胞內表達的重組瓊膠酶，則用6 000 r/min 5 min離心收集誘導的重組菌（100 mL），加入20 mL的Tris-Cl緩沖液（20 mmol/L，pH8.0）重懸菌體，冰浴中超聲破碎至澄清。破碎液12 000 r/min離心10 min，上清即作為重組瓊膠酶初酶液，-20℃保存備用；對于在大腸桿菌胞外表達的重組瓊膠酶，則用12 000 r/min 5 min離心誘導的重組菌發酵液，取上清；用硫酸銨沉淀蛋白，蛋白沉淀中加入適量的Tris-Cl緩沖液（20 mmol/L，pH8.0）溶解，經用同樣的Tris-Cl緩沖液多次透析后，用聚乙二醇20000濃縮，濃縮液經12 000 r/min離心10 min，上清即作為重組瓊膠酶初酶液，-20℃保存備用。

1.2.4 DNS法測定瓊膠酶活性 瓊膠酶降解瓊脂，產生還原性末端，與3，5-二硝基水楊酸（DNS）結合，發生變色反應，顏色變化與還原糖的生成量成正比，即與酶活成正比［14］。通過這種有顏色的產物在540 nm處有特殊吸收值，故根據540 nm光吸收值查對標準曲線確定還原糖產生量，定為酶的活力單位。定義每毫升（mL）酶液每分鐘內產生1 μmol還原糖的酶量為1 U。標準曲線的制作以D-半乳糖作為還原糖。

每100 μL粗酶液加入900 μL的含0.25%瓊脂的Tris-Cl緩沖液（20 mmol/L，pH8.0），42℃溫浴15 min，對照樣品沸水浴中滅活10 min。加入DNS試劑 2 mL，沸水浴中顯色15 min，快速冷卻中止反應，加蒸餾水定容至10 mL。OD540nm處測吸光值，對比標準曲線，計算酶活。

1.2.5 重組瓊膠酶的最適反應溫度 考慮到反應溫度可能對瓊膠酶降解瓊脂糖影響較大，因此需要測定各個瓊膠酶的最適反應溫度。設置溫度為30-70℃，間隔5℃。每100 μL酶液加入900 μL的含0.25%瓊脂的Tris-Cl緩沖液（20 mmol/L，pH8.0），在各個溫度下反應15 min，DNS法測定瓊膠酶活性。

1.2.6 重組瓊膠酶降解瓊脂糖的產物分析 將瓊膠酶酶液1 mL與1 mL的底物（含1.0%瓊脂糖的Tris-Cl緩沖液，20 mmol/L，pH8.0）混合，在最適合反應溫度下溫浴24 h，12 000 r/min離心10 min，上清即作為薄層層析的樣品。作瓊膠酶對瓊脂糖的降解譜分析時，即在不同間隔時間（5 min、15 min、30 min、1 h、2 h、12 h、24 h）取樣，沸水浴5 min終止反應，離心，上清待用于上樣。

薄層層析板使用前置于110℃烘箱中干燥1 h。在層析板上距離底部1 cm處用鉛筆劃出底線，將樣品10 μL點于底線上，用風筒吹干，置于自制層析缸中展層。展開劑配方為正丁醇∶冰乙酸∶水= 2∶1∶1（體積比）。待前沿線到達離層析板頂端1 cm處時停止展層，烘箱中干燥。最后往層析板噴灑10%的硫酸（體積比），85℃烘箱中顯色。

由于市面上缺乏瓊膠寡糖標準品，因此本試驗利用本課題組所獲得的瓊膠酶制備瓊膠寡糖用作標準品，具體方法參照文獻［13］所述。

1.2.7 重組瓊膠酶降解瓊膠寡糖的研究 將瓊膠寡糖與等體積的瓊膠酶酶液混合，在最適合反應溫度下溫浴12 h，12 000 r/min離心5 min，上清即作為薄層層析的樣品。

2 結果

2.1 菌株HZ105的瓊膠酶基因克隆

本課題組在前期研究中對菌株HZ105瓊膠酶進行了串聯質譜分析［12］，發現菌株HZ105的瓊膠酶與菌株Aagarivorans sp. JAMB-A11的一個瓊膠酶AgaA匹配分數最高，經序列比對發現后者又與菌株Vibrio sp.JT0107和Vibrio sp. PO-303的瓊膠酶具有較高的序列相似性，因此嘗試以報道的這些相近瓊膠酶基因序列設計引物對菌株HZ105的基因組進行PCR擴增，并由此得到了4個瓊膠酶基因（hz1，hz2，hz3，hz4），經測序它們的長度分別是2 988，2 868，1 437 和1 362 bp。將這4個基因的序列提交到GenBank，登錄號分別是HQ625020、HQ625021、HQ625022和HQ625023。此前本課題組已經研究報道了菌株HZ105的瓊膠酶基因hz2及其編碼的瓊膠酶HZ2的性質［13］，本研究將描述菌株HZ105其他3個瓊膠酶的性質。

2.2 瓊膠酶基因序列分析

將獲得的菌株HZ105的瓊膠酶基因序列（hz1，hz3，hz4）在NCBI網站上進行Blastn比對，結果發現這4個瓊膠酶基因均與一些報道的β-瓊膠酶基因序列具有較高的相似性。其中基因hz1、hz3均有與同為Agarivorans屬的瓊膠酶基因具有97%以上的相似性，HZ1與Agarivorans sp. QM38的agaD01只有2個氨基酸差別，但目前未見有關瓊膠酶agaD01性質的報道。而在Blastn搜索結果中hz4只與菌株Pseudoalteromonas sp. CY24的agaA基因、Vibrio sp. PO-303的agaD基因匹配。本研究首次報道Agarivorans屬細菌中單一菌株含有4個瓊膠酶基因。鑒于菌株HZ105的4個瓊膠酶基因均與菌株Vibrio sp. PO-303的瓊膠酶基因序列有較高的相似性，而Vibrio sp. PO-303 還擁有第5個瓊膠酶基因AgaA，因此嘗試以該基因序列設計多對引物對菌株HZ105基因組進行PCR擴增，但均未獲成功，說明菌株HZ105可能不擁有與菌株Vibrio sp. PO-303的瓊膠酶基因AgaA相似的基因。

據報道，菌株Vibrio sp.JT0107的瓊膠酶基因agaB位于agaA的上游［16］，而本文菌株HZ105的基因hz2、hz1分別與agaB、agaA有較高的相似性，因此設計引物Jh21（表1）以擴增兩者的間隔區。測序發現，基因hz2和hz1間隔74 bp，與菌株Vibrio sp. JT0107的基因agaB和agaA的間隔序列（Genbank登錄號=D14721）有100%相似性，但兩菌株的瓊膠酶基因并沒有100%相似性。

瓊膠酶基因（hz1，hz3，hz4）分別編碼995 aa、478 aa、453 aa，分別命名為瓊膠酶HZ1、HZ3和HZ4，用DNAStar軟件推測的分子量大小分別是107.4、50.9和50.8 kD。按照氨基酸序列相似性以及CAZy數據庫的分類［17］，瓊膠酶HZ1、HZ3和HZ4分別應屬于糖苷水解酶GH50、GH118和GH16家族。

2.3 瓊膠酶基因的重組原核表達

將瓊膠酶基因hz1、hz3和hz4按照表1中的限制性酶酶切位點與質粒pET-32（a）連接，成功構建了重組表達載體，并轉入大腸桿菌BL21（DE3）中，獲得了重組表達菌，并制備了具有較高活性的重組瓊膠酶。其中瓊膠酶HZ1不包括信號肽序列，經SDS-PAGE檢測，主要在大腸桿菌胞內表達；HZ3和HZ4則包含信號肽序列，經SDS-PAGE檢測，主要在大腸桿菌胞外表達。

2.4 重組瓊膠酶的最適反應溫度

由圖1可知，瓊膠酶HZ1的最適合反應溫度是60℃；瓊膠酶HZ3的最適合反應溫度在40-45℃之間；瓊膠酶HZ4在35-50℃之間的酶活力均比較接近，最適溫度是50℃。

圖1 不同溫度對瓊膠酶活性影響

2.5 重組瓊膠酶降解瓊脂糖和瓊膠寡糖的產物分析

根據瓊膠酶對瓊脂糖降解不同時間的產物的薄層層析分析，可知瓊膠酶HZ1降解瓊脂糖的產物在開始階段是聚合度較高的寡糖，最終產物是新瓊二糖（NA2）和新瓊四糖（NA4）（圖2-A）。

圖2 瓊膠酶HZ1對瓊脂糖和瓊膠寡糖的降解

由圖2-B可知，往NA4添加瓊膠酶HZ1后，NA4沒有被降解，說明HZ1不能降解四糖，這與HZ1降解瓊脂糖的終產物有NA4相符合。但HZ1可以降解NA6為NA4和NA2，也可以將聚合度為8/10/12/14的新瓊寡糖混合物降解為NA4和NA2。

瓊膠酶HZ3降解瓊脂糖的主要產物是NA8、NA10、NA12和NA14（圖3），它不能進一步降解這些寡糖，也不能降解NA4和NA6（圖未展示）。

圖3 瓊膠酶HZ3對瓊脂糖的降解

而瓊膠酶HZ4在開始階段對瓊脂糖的降解類似瓊膠酶HZ1，也是些聚合度較高的寡糖，最終產物是NA4和NA6（圖4-A）。HZ4降解聚合度為8/10/ 12/14的寡糖混合物得到NA4和NA6（圖4-B）。

圖4 瓊膠酶HZ4對瓊脂糖和瓊膠寡糖的降解

3 討論

瓊膠酶HZ1的最適合反應溫度是60℃，這在目前所報道的瓊膠酶中是比較高的。菌株Agarivorans sp. AG17 的瓊膠酶AG17與HZ1差別7個氨基酸，AG17的最適合反應溫度是65℃［10］，與HZ1比較接近。而與HZ1分別差別4個、9個氨基酸的AgaA11（來自Agarivorans sp. JAMB-A11）、AgaJA1（來自 Agarivorans sp. JA-1）的最適合反應溫度都是40℃［5，6］，這與HZ1差別比較大。與瓊膠酶HZ3氨基酸序列相似性高的Pseudoalteromonas sp. CY24的 agaB是 40℃［18］，Vibrio sp. PO-303的 agaC是35℃［19］，三者比較接近。而與HZ4分別差別2個、10個氨基酸的agaA（來自Pseudoalteromonas sp. CY24）、agaD（來自Vibrio sp. PO-303）的最適合反應溫度都是40℃［20，21］。

與HZ1序列接近的瓊膠酶中，AgaJA1（來自 Agarivorans sp. JA-1）［6］和 菌 株Agarivorans sp. AG17 的瓊膠酶AG17［10］降解瓊脂糖的終產物也主要是NA2和NA4，與HZ1類似。AgaA11（來自Agarivorans sp. JAMB-A11）的終產物則是NA2［5］。而AgaA11和AgaJA1均可將NA4和NA6降解為NA2，與HZ1不同。菌株Agarivorans sp. AG17 的瓊膠酶AG17可以將NA6降解為NA4和NA2，這與HZ1類似。

與HZ3序列接近的瓊膠酶中，Pseudoalteromonas sp. CY24的agaB降解瓊脂糖的終產物主要是NA8和NA10［18］，還有少量的NA4和NA6。Vibrio sp. PO-303的agaC產物主要是NA4、NA6和NA8［19］。agaB和agaC都不能降解NA8，但它們都可以降解NA10。但本研究中的HZ3卻與之有所區別，并不能降解NA8、NA10、NA12和NA14。

與HZ4序列接近的瓊膠酶中，Pseudoalteromonas sp. CY24的agaA降解瓊脂糖的終產物也是NA4和NA6，降解NA8得到NA4和NA6［20］，與HZ4一樣。Vibrio sp. PO-303的agaD的產物主要是NA4，還有少量的NA2和NA6，還能夠將NA6降解為NA4和NA2［21］，這與HZ4不一樣。

雖然菌株HZ105的瓊膠酶與其他菌株的瓊膠酶具有較高的序列相似性，但這些瓊膠酶在部分性質上存在較大差異。目前已有研究表明瓊膠酶的部分氨基酸殘基的改變導致酶性質差異。如Han等［22］研究發現菌株Flammeovirga sp. MY04的一個β-瓊膠酶AgaG4的催化區里面有一個額外的肽段Asn（246）-Gly（302），這個肽段的切除導致該酶不能降解新瓊八糖。因此有待進行突變進一步確認是否是少量的氨基酸差別導致了菌株HZ105的瓊膠酶與其他菌株的瓊膠酶的性質差異。

隨著基因測序技術的發展，到目前為止已有少數產瓊膠酶細菌得到基因組測序。但這些基因組得到測序的菌株中，其瓊膠酶降解系統被研究得很少。最近，Yasuike等［23］報道了Agarivorans屬瓊膠降解菌中第一個基因組，但是并未提及基因組中的瓊膠酶基因。菌株Saccharophagus degradans 2-40 是目前已得到基因組測序并且其瓊膠降解體系得到較全面研究的菌株。Ekborg等［24］鑒定了該菌株的5個瓊膠酶，其中2個屬于糖水解酶GH50家族，1個屬于GH16家族，2個屬于GH86家族；最終通過研究認為該菌株的瓊膠降解系統包括：一個胞外的內切GH16家族瓊膠酶，一個位于細菌表面的GH50家族瓊膠酶，一個外切的GH86家族瓊膠酶，以及一個新瓊二糖水解酶。

Liu等［25，26］最近先后報道了菌株Agarivorans gilvus WH0801的兩個瓊膠酶AgWH50A和AgWH-50C，這兩個酶均屬于GH50家族。而本研究報道了菌株Agarivorans sp. HZ105中瓊膠酶HZ2之外的其他3個瓊膠酶，HZ1降解瓊脂糖得到NA2和NA4；HZ2降解瓊脂糖得到NA4［6］；HZ1和HZ2均可以將聚合度為6/8/10/12/14的新瓊寡糖降解為NA2和NA4；HZ3降解瓊脂糖的終產物是聚合度為8/10/12/14的新瓊寡糖；HZ4降解瓊脂糖和高聚合度新瓊寡糖為NA6和NA4。因此，推測菌株HZ105主要先用GH118家族瓊膠酶HZ3和GH16家族瓊膠酶HZ4降解瓊脂糖為較高聚合度的新瓊寡糖，隨后這些寡糖被GH50家族瓊膠酶HZ1和HZ2降解為低聚合度寡糖。

4 結論

本文首次報道了Agarivorans屬中能產生4個瓊膠酶的細菌-菌株HZ105。瓊膠酶HZ3和HZ4降解瓊脂糖為較高聚合度的新瓊寡糖，隨后這些寡糖被瓊膠酶HZ1和HZ2降解為低聚合度寡糖。本課題組首次較系統地研究了Agarivorans屬細菌中的瓊膠降解酶系，豐富了對細菌降解瓊膠的酶體系的認識，也有利于菌株HZ105瓊膠酶的應用開發。

［1］ Hu B， Gong QH， Wang Y， et al. Prebiotic effects of neoagarooligosaccharides prepared by enzymatic hydrolysis of agarose［J］. Anaerobe， 2006， 12（5-6）：260-266.

［2］ Wang JX， Jiang XL， Mou HJ， et al. Anti-oxidation of agar oligosaccharides produced by agarase from a marine bacterium［J］. J Appl Phycol， 2004， 16（5）：333-340.

［3］ 陳海敏， 嚴小軍， 王峰， 等. 瓊膠寡糖抑制血管形成作用的研究［J］. 營養學報， 2007， 29（4）：405-407.

［4］Lee DG， Jang MK， Lee OK， et al. Over-production of a glycoside hydrolase family 50 β-agarase from Agarivorans sp. JA-1 in Bacillus subtilis and the whitening effect of its product［J］. Biotechnol Lett，2008， 30（5）：911-918.

［5］ Ohta Y， Hatada Y， Ito S， et al. High-level expression of a neoagarobiose- producing-agarase gene from Agarivorans sp. JAMB-A11 in Bacillus subtilis and enzymic properties of the recombinant enzyme［J］. Biotechnol Appl Bioc， 2005， 41（Pt 2）：183-191.

［6］ Lee DG， Park GT， Kim NY， et al. Cloning， expression， and characterization of a glycoside hydrolase family 50 β-agarase from a marine Agarivorans isolate［J］. Biotechnol Lett， 2006， 28（23）：1925-1932.

［7］ Lee DG， Jeon MJ， Lee SH. Cloning， expression， and characterization of a glycoside hydrolase family 118 beta-agarase from Agarivorans sp. JA-1［J］. J Microbiol Biotechnol， 2012， 22（12）：1692-1697.

［8］Long M， Yu Z， Xu X. A novel beta-agarase with high pH stability from marine Agarivorans sp. LQ48［J］. Mar Biotechnol， 2010， 12（1）：62-69.

［9］ Fu XT， Pan CH， Lin H， et al. Gene cloning， expression， and characterization of a beta-agarase， agaB34， from Agarivorans albus YKW-34［J］. J Microbiol Biotechnol， 2009， 19（3）：257-264.

［10］ Nikapitiya C， Oh C， Lee Y， et al. Characterization of a glycoside hydrolase family 50 thermostable beta agarase AG17 from marine bacteria Agarivorans sp. AG17［J］. Fish Aquat Sci， 2010， 13（1）：36-48.

［11］ Du Z， Wang J， Yang L， et al. Identification of a marine agarolytic bacterium Agarivorans albus QM38 and cloning and sequencing its beta-agarase genes［J］. Acta Oceanol Sin， 2011， 30（1）：118-124.

［12］Hu Z， Lin BK， Xu Y， et al. Production and purification of agarase from a marine agarolytic bacterium Agarivorans sp.HZ105［J］. J Appl Microbiol， 2009， 106（1）：181-190.

［13］Lin BK， Lu GY， Zheng YD， et al. Gene cloning， expression and characterization of a neoagarotetraose-producing β-agarase from a marine bacterium Agarivorans sp.HZ105［J］. World J Microb Biot， 2012， 28（4）：1691-1697.

［14］Miller GL. Use of dinitrosaIicyIic acid reagent for determination of reducing sugar［J］. Anal Chem， 1959， 31（3）：426-428.

［15］Dong J， Tamaru Y， Araki T. A unique beta-agarase， AgaA， from a marine bacterium， Vibrio sp. strain PO-303［J］. Appl Microbiol Biot， 2007， 74（6）：1248-1255.

［16］Sugano Y， Matsumoto T， Noma M. Sequence analysis of the agaB gene encoding a new β-agarase from Vibrio sp. strain JT0107［J］. Bioch Bioph Acta， 1994， 17（1）：105-108.

［17］Cantarel BL， Coutinho PM， Rancurel C， et al. The Carbohydrate-Active EnZymes database（CAZy）：an expert resource for Glycogenomics［J］. Nucleic Acids Res， 2009， 37：D233-238.

［18］Ma C， Lu X， Shi C， et al. Molecular cloning and characterization of a novel β-Agarase， AgaB， from marine Pseudoalteromonas sp. CY24［J］. J Biol Chem， 2007， 282（6）：3747-3754.

［19］Dong J， Hashikawa S， Konishi T， et al. Cloning of the novel gene encoding beta-agarase C from a marine bacterium， Vibrio sp. strain PO-303， and characterization of the gene product［J］. Appl Environ Microb， 2006， 72（9）：6399-401.

［20］Lu X， Chu Y， Wu Q， et al. Cloning， expression and characterization of a new agarase-encoding gene from marine Pseudoalteromonas sp.［J］. Biotechnol Lett， 2009， 31（10）：1565-1570.

［21］ Dong J， Tamaru Y， Araki T. Molecular cloning， expression and characterization of a β-agarase gene， agaD， from a marine bacterium， Vibrio sp.strain PO-303［J］. Biosci Biotech Bioch， 2007， 71（1）：38-46.

［22］ Han WJ， Gu JY， Liu HH， et al. An extra peptide within the catalytic module of a β-Agarase affects the agarose degradation pattern［J］. J Biol Chem， 2013， 288：9519-9531.

［23］ Yasuike M， Nakamura Y， Kai W， et al. Draft genome sequence of Agarivorans albus strain MKT 106T， an agarolytic marine bacterium［J］. Genome Announc， 2013， 1（4）：e00367-13.

［24］ Ekborg NA， Larry ET， Atkinson GL， et al. Genomic and proteomic analyses of the agarolytic system expressedby Saccharophagus degradans 2-40［J］. Appl Environ Microb， 2006， 72（5）：3396-3405.

［25］ Liu N， Mao X， Du Z， et al. Cloning and characterisation of a novel neoagarotetraose- forming-beta-agarase， AgWH50A from Agarivorans gilvus WH0801［J］. Carbohyd Res， 2014， 388：147-151.

［26］ Liu N， Mao X， Yang M， et al. Gene cloning， expression and characterization of a new beta-agarase， AgWH50C， producing neoagarobiose from Agarivorans gilvus WH0801［J］. World J Microb Biot，2014， doi：10.1007/s11274-013-1591-y.

（責任編輯 李楠）

The Agar-degrading Enzymatic System of Marine Bacterium Agarivorans sp.HZ105

Lin Bokun1，2Lu Guoyong2Song Yan2Xie Ruiquan3Chen Honglin1Hu Zhong1，2
（1. Medical College，Shantou University，Shantou 515041；2. Department of Biology，Science College，Shantou University，Shantou 515063；3. Shantou Yuccor Biotechnology co. ltd，Shantou 515041）

Three agarase genes（hz1， hz2， hz3）of 2 988 bp， 1 437 bp and 1 362 bp respectively， were cloned from strain Agarivorans sp.HZ105. These three agarase genes（hz1， hz2， hz3）encoded agarase HZ1， HZ3 and HZ4 and belonged to glycoside hydrolase family GH50， GH118 and GH16， respectively. The agarase genes of strain HZ105 were linked with vector pET-32a（+）and then were transfered to Escherichia coli BL21（DE3）. These agarase genes were successfully expressed in E. coli cells and their recombinant agarases were prepared. Agarose degradations of the recombinant agarases were studied. Agarase HZ1 could degrade agarose and neoagarooligosaccharides with high degrees of polymerization（8， 10， 12 and 14）into neoagarobiose and neoagarotetraose. Agarase HZ3 digested agarose to produce neoagarooligosaccharides with high degrees of polymerization， while agarase HZ4 decomposed agarose and neoagarooligosaccharides with high degrees of polymerization to yield neoagarotetraose and neoagarohexaose. Therefore， strain HZ105 might produce firstly agarases HZ3 and HZ4 to degrade agarose into neoagarooligosaccharides with high degrees of polymerization， and the products of agarases HZ3 and HZ4 would be then digested into neoagarooligosaccharides with low degrees of polymerization by agarase HZ1 and another agarase（HZ2）from strain HZ105 reported previously by our research group. Strain HZ105 is the first reported strain that produces four agarases and this study is the first report of the agar-degrading enzymatic system in the genus Agarivorans. The results could enrich the knowledge about the bacterial agar-degrading enzymatic system and the roles of the agarases in the system. The application of agarases from strain HZ105 should also benift from this study.

agarase；gene cloning；Agarivorans；enzymatic system；degradation products

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.01.024

2014-05-23

國家自然科學基金項目（31200077，41476150），中國博士后科學基金項目（2013M531871），廣東省自然科學基金項目（S2012040006279），廣東省科技計劃項目（2011B031100006）

林伯坤，男，博士，研究方向：微生物學生化與分子；E-mail：biotech_1@stu.edu.cn

胡忠，男，教授，研究方向：微生物學，E-mail：hzh@stu.edu.cn；陳鴻霖，男，教授，研究方向：微生物學；E-mail：hlchen@hku.hk