丹參根腐病生防芽孢桿菌2-1海藻菌劑的研制

周瑩 袁孟娟 韓軍 陳芳

（聊城大學藥學院，聊城252059）

丹參根腐病生防芽孢桿菌2-1海藻菌劑的研制

周瑩 袁孟娟 韓軍 陳芳

（聊城大學藥學院，聊城252059）

以海藻渣為載體，菌種為丹參根腐病生防菌：枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis2-1（已保存CGMCC No.9256），研制成的海藻菌劑兼具營養及生物防治功能，同時菌劑的基本指標符合農用微生物菌劑產品的技術指標。用物理方法選擇菌種發酵液與海藻渣混合的最佳配比，結合農用微生物菌劑產品質量檢測方法對菌劑中有效活菌數、含水量、pH值及有效期進行測定，并進行大田試驗，測試生防效果。菌劑有效活菌數為2.32×109/g，含水量為6.75%，pH值為6.7，常溫下有效期約為11.6個月，均符合顆粒菌劑的技術指標，大田試驗中根腐病的發病率比空白對照組降低37.6%，生防效果較為顯著。

根腐病；生防菌；海藻菌劑；制備

非致病性枯草芽孢桿菌2-1是從本地感染根腐病的丹參根際土壤篩選分離得出，對丹參根腐病具有生物防治作用的一種生防菌，生防機制是該枯草芽孢桿菌的代謝產物對丹參根腐病病原菌——腐皮鐮刀菌（Fusarium solani）［1，2］具有抑制作用［3-7］。根腐病作為一種嚴重的根莖類病害，對中藥材的品質及產量都造成了很大的影響（圖1，圖2）。一直以來，人們對丹參根腐病的防治大都依賴化學藥劑及一些合理的耕作管理方法，但作為一種不易根治的土傳病害，根腐病一旦病發，就需施用大量藥物，一方面造成了環境污染，另一方面還影響了中藥材的出口貿易［8-10］。由此可見，生物農藥的推廣是我國農業可持續發展的迫切需求。生物防治具有環保無污染的特點，因此將生防菌劑應用到中藥材根腐病的防治中意義重大［11，12］。目前用于防治根腐病的生防菌劑在國內外還較為少見，國內登記的微生物農藥主要用于小麥全蝕病、水稻和小麥紋枯病及果蔬枯萎病，其中有兩種生防菌劑用于防治根腐病，分別為“百抗”和“根腐消”，且都是用于三七根腐病［13］，但針對丹參根腐病的生防菌劑還未見報道，故值得深入研究。海藻渣中含粗蛋白約20%，粗纖維約50%，灰分約3%，海藻渣中還含特有的有效活性成分，不僅使其成為優良的有機肥，還可以作為生防菌的載體應用到農業生產中。本試驗利用物理方法及生物方法制備出的海藻生防菌劑，兼具海藻營養及生物菌劑的活體調節功能，實現了促進植物生長，防治根腐病害的雙贏目的。

圖1 感染根腐病丹參根部（左）與正常丹參根部（右）

圖2 根腐病丹參根部縱剖圖

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 培養基 LB固體培養基及LB液體培養基（配制方法略）。

1.1.2 菌種及海藻 實驗室保存枯草芽孢桿菌2-1，無菌鮮海藻渣由青島明月海藻公司提供。

1.1.3 儀器與設備 立式壓力蒸汽滅菌器：上海博迅實業有限公司醫療設備廠（BXM-30R）；電熱恒溫鼓風干燥箱：蘇州江東精密儀器有限公司（DGG-9070A）；實驗室pH計：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司（FE20）；快速水分測定儀：Metrohm Herisau S（885 Compact OvenSC）；漩渦混合器：IKA LAB DANCER（07.433333）；超凈工作臺：江蘇通凈凈化設備有限公司（SW-CJ-2FD）；恒溫培養箱：上海新苗醫療器械制造有限公司（QYC-2102C）；生化培養箱：上海新苗醫療器械制造有限公司（SPX-150BSH-Ⅱ）；電子天平：奧豪斯儀器（上海）有限公司（GB/T26497）；微波爐：廣東格蘭仕微波爐電器制造有限公司（G70D20CNIP-D2CSO）；1 mL、0.1 mL移液槍：德國，Eppendorf。

1.2 方法

1.2.1 接種發酵 在無菌操作條件下，用0.1 mL移液槍將保存在甘油管中的菌種接種到LB液體培養基中。將接種完畢的三角瓶置于30℃恒溫箱中，轉速160 r/min，培養18 h。

1.2.2 發酵液菌種單一性鑒定 在無菌條件下，取1 mL菌液進行梯度稀釋，取10-8濃度的菌懸液0.1 mL，在LB固體培養基平板上進行涂布。室溫下靜置5-10 min后，倒置于恒溫培養箱，30℃過夜培養。觀察菌落形態是否一致，包括色澤、是否有褶皺、致密或者疏松、質地、邊緣溝紋等。細菌鑒定參照《常見細菌系統鑒定手冊》［14，15］。隨機挑取幾個菌落制片，分別經革蘭氏、芽孢染色，顯微鏡下觀察菌體大小及顏色是否一致。

1.2.3 鮮海藻渣水分測定 取適量鮮海藻渣，用卡式快速水分測定儀測定其水分含量。

1.2.4 海藻菌劑初成品制備 選含水30%的海藻渣作為制備初成品的載體，按1 mL發酵菌液分別對應2 g，3 g，4 g，5 g含水30%海藻渣（后面簡稱1∶2，1∶3，1∶4，1∶5）的比例，計算出各比例需要的原鮮海藻渣，將菌液與海藻渣混合均勻，難以混合均勻時需加適量無菌水。放入25℃恒溫干燥箱中干燥至含水30%。

1.2.5 最佳配比的確定 用電子天平準確稱取1.000 g初成品菌劑，放入9 mL無菌水中，充分溶解后作梯度稀釋。在無菌條件下，分別取10-6、10-7、10-8［16，17］濃度的菌懸液0.1 mL，在LB固體培養基平板上進行涂布并標記。室溫下靜置5-10 min后，倒置于30℃恒溫培養箱中培養24 h。觀察菌落成長情況，確定菌液與海藻渣的最佳配比。

1.2.6 含水量的測定 將初成品的海藻菌劑，置于室內自然風干2 d成顆粒成品，取適量測定其水分含量。

1.2.7 pH值的測定 將顆粒成品研過1.00 mm試驗篩，稱取過篩樣品粉末15 g，放入50 mL的燒杯中，按1∶5的比例用去離子水溶解樣品，攪拌均勻。然后靜置30 min，測樣品上清液的pH值，儀器讀數穩定后記錄，重復測試3次求平均值。

1.2.8 有效期的測定 取1 g菌劑于常溫（25℃）、50℃、70℃下的恒溫干燥箱中保存，然后間隔一定時間（0、8、24、36、60、84 h）后取樣。根據在50℃、70℃及常溫3個溫度下進行加速試驗所測得的活菌數，參照溫度加速法，對有效期進行測定［18］。細菌死亡屬于熱力學一級速度過程［19］，在一定條件下符合下述方程：

其中N0為原始菌體數，Nt為t時殘存的菌體數，k為速度常數，用LogN對t作圖，即可得斜率，求出各溫度下的速度常數k值。

加速試驗中的經典恒溫法的理論依據是指數定律［20］，其對數形式為：

其中A為頻率因子，Ea為反應活化能，T為絕對溫度，R為氣體常數。以Logk對1/T作圖得斜率-Ea/2.303 R，及Y軸截距LogA，即可得出活化能Ea，A值，帶回原式即可求得常溫下菌劑的貯存期。

1.2.9 大田試驗 將制備好的海藻顆粒菌劑按20 g/m2在丹參生長過程中施用3次，并設置多菌靈藥液對照組及空白對照組［21］。統計各組發病率及丹參實際產量。

2 結果

2.1 發酵液菌體單一性鑒定

觀察菌落，基本特征一致，均為枯草芽孢桿菌的特征：菌落呈圓形，表面粗糙不透明，污白色，中間褶皺，邊緣波紋狀，經革蘭氏染色均呈陽性，芽孢染色可見呈現綠色的橢圓或柱狀的芽孢體。菌體顏色大小均一致。

2.2 海藻菌劑初成品制備

經測定鮮海藻渣的含水量為87.3%，按4個比例做成的初成品如圖3、圖4所示。重復多次平行試驗后，得出1∶4為最佳比例（圖5-圖8），即1 mL菌液對應4 g含水30%的海藻渣時，有效活菌數≥2.32×109/g，符合農用微生物菌劑產品的技術指標，（指標要求：顆粒制劑有效活菌數需≥1× 108/g，見附錄）。

圖3 菌液與海藻渣混勻

圖4 干燥至含水30%的初成品

圖5 1∶2比例菌落生長情況

圖6 1∶3比例菌落生長情況

圖7 1∶4比例菌落生長情況

圖8 1∶5比例菌落生長情況

2.3 含水量測定

經卡氏快速水分測定儀對靜置干燥后的成品含水量進行測試，測得含水量為6.75%，符合農用微生物菌劑產品的技術指標，（指標要求：顆粒制劑水分含量需≤20%，見附錄）。

2.4 pH值測定

用pH計測得pH平均值為6.7，符合農用微生物菌劑產品的技術指標，（指標要求：顆粒制劑pH值范圍為5.5-8.5，見附錄）。

2.5 有效期測定

分別在常溫（25℃），50℃，70℃三個溫度下，不同時間點取樣品對其中有效生防菌數量進行測定（表1-表3），并繪制各時間點活菌數的自然對數Log（N，%）對時間（t）圖（圖9-圖11），分別得到各個溫度時的一元線性回歸方程，K值及LogK值（表4）。

表1 25℃加速試驗各時間點樣品的測定結果

表2 50℃加速試驗各時間點樣品的測定結果

表3 70℃加速試驗各時間點樣品的測定結果

圖9 25℃ Log（N，%）/t線性回歸圖

圖10 50℃ Log（N，%）/t線性回歸圖

圖11 70℃ Log（N，%）/t線性回歸圖

表4 生防芽孢桿菌在不同溫度條件下的回歸方程

再對Logk對1/T做線性回歸圖（圖12），運用Arrhenius方程計算得出Ea值為4 318.85，A值為730.5，并計算出海藻菌劑的有效期為8 384 h約為11.6個月，符合農用微生物菌劑產品的技術指標，（指標要求：顆粒制劑保質期需≥6個月，見附錄）。

圖12 Logk對1/T的線性回歸圖

2.6 大田試驗結果

試驗統計，施用海藻菌劑的丹參長勢明顯好于多菌靈組及空白組，根腐病發病率比空白組降低約37.6%，與多菌靈效果相當，但施用海藻菌劑的丹參實際產量要明顯高于多菌靈組及空白組，分別高出11%，18.4%，說明海藻顆粒菌劑的生防及營養效果均較好。

3 討論

枯草芽孢桿菌抗逆性強，易于定殖，能產生多種抗菌素和酶，具有廣譜抗菌活性［22-24］。目前國內外已有將其成功用于植物病害防治的報道。在我國，已登記的防治土傳病害的微生物農藥有14種，其中以枯草芽孢桿菌為生防菌的有6種，主要用于水稻和小麥紋枯病的防治［25］，近幾年已迅速推廣應用到番茄青枯病、棉花黃萎病、辣椒枯萎病、西瓜枯萎病、煙草黑脛病、水稻稻瘟病及甘藍黑腐病等各種作物或果蔬的嚴重病害［26］。國外應用枯草芽孢桿菌防治植物病害較成功的實例有美國Agraquest公司用QST713菌株和QST2808菌株分別開發出活菌殺菌劑SerenadeTM和Sonata AS，并于2000年登記，用于防治蔬菜、櫻桃、葡萄、葫蘆和胡桃等多種作物的白粉病、霜霉病、疫病及灰霉病等［27］。其他國家也有用于防治馬鈴薯、玉米、蔬菜類和觀賞植物的真菌病害的枯草芽孢桿菌菌劑［28］。可見，枯草芽孢桿菌用于生物防治已深受認可。大多數的生物菌劑為粉劑或液體，顆粒菌劑較少，海藻作為一種優良的菌劑載體，近幾年愈發受到關注，本試驗將根腐病生防枯草芽孢桿菌吸附于海藻渣后制備顆粒菌劑，并對初成品的物理及生物指標進行了測定，效果良好，推動了丹參根腐病害的生物防治研究。

4 結論

經初步測定，海藻生防菌劑的水分含量，pH值，有效期等均符合農用顆粒微生物菌劑產品的技術指標，說明海藻渣作為菌劑載體的效果是較好的。且在大田試驗中，海藻顆粒菌劑的生防效果與多菌靈效果相當，營養助長效果明顯。目前已有一些企業在探索海藻菌肥的研發并運營至市場，作為一種將營養與生物防治于一體的復合菌劑，海藻菌劑有著廣大的應用前景，值得深入研究。

附錄：農用微生物菌劑產品的技術指標（中華人名共和國國家標準GB 20278-2006，2006年9月1日起實施）

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（責任編輯 李楠）

Preparation of Algae Agents for S. miltiorrhiza Bunge Root Rot Biocontrol Bacillus subtilis2-1

Zhou Ying Yuan Mengjuan Han Jun Chen Fang
（School of Pharmaceutical，Liaocheng University，Liaocheng 252059）

With algae residue as carrier， S. miltiorrhiza bunge root rot biocontrol agents： Bacillus subtilis2-1（CGMCC No.9256），were developed into algae agents， which features both nutritional and cell biological control function， also in line with the basic indicators of agricultural products， technical indicators microbial agents. Then appropriate ratio of seaweed broth and residue was chosen by physical means. Besides， the number of viable cells， moisture content， pH value and expiration date were measured by agricultural product quality testing methods， and field experiments was conducted to test biocontrol effect. Results showed that number of effective viable agents was 2.32×109/ g， moisture content was 6.75%， pH value was 6.7， and the expiration date was about 11.6 months ， all of which were in line with the technical specifications of the particles. The incidence of root rot in field trials rate decreased 37.6% compared with the blank control group， the effect of biocontrol was obvious.

root rot；biocontrol；algae agents；preparation

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.01.025

2014-09-28

山東省自然科學基金項目（ZR2013CQ019），聊城大學博士科研啟動基金項目（3010）

周瑩，女，碩士研究生，研究方向：生物制藥，E-mail：hebe11183@yeah.net

陳芳，女，博士，副教授，研究方向：微生物制藥，E-mail：chenfang20045@163.com