敏捷食酸菌腈水解酶基因在大腸桿菌中的表達(dá)

管啟旺 馬江鋒 賀愛(ài)永 姜岷 宮長(zhǎng)斌

（南京工業(yè)大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院 材料與化學(xué)工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 211816）

敏捷食酸菌腈水解酶基因在大腸桿菌中的表達(dá)

管啟旺 馬江鋒 賀愛(ài)永 姜岷 宮長(zhǎng)斌

（南京工業(yè)大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院 材料與化學(xué)工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 211816）

以含有敏捷食酸菌的腈水解酶基因的克隆質(zhì)粒為模板，通過(guò)PCR擴(kuò)增獲得長(zhǎng)度為1 080 bp的腈水解酶（Nitrilase）基因片段。使用表達(dá)質(zhì)粒pET-28-a構(gòu)建表達(dá)載體，獲得重組質(zhì)粒pET-Nit。對(duì)所表達(dá)的基因進(jìn)行測(cè)序?qū)Ρ劝l(fā)現(xiàn)與GenBank所公布的基因序列比較，相似性99%，讀碼框出現(xiàn)2 bp的突變，但并未引起相應(yīng)氨基酸突變，故不影響酶的表達(dá)與特性。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到表達(dá)宿主Escherichia coli Rosetta（DE3）感受態(tài)中，使用誘導(dǎo)劑IPTG對(duì)菌株進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，獲取菌液進(jìn)行SDS-PAGE分析，得知目的蛋白分子量約為41.28 kD，與預(yù)期所想的一致。酶活力分析表明，上清的比活力為3 U/mg。進(jìn)一步對(duì)誘導(dǎo)條件進(jìn)行優(yōu)化，包括誘導(dǎo)溫度，IPTG濃度，誘導(dǎo)時(shí)間等一系列條件。在最優(yōu)條件下，擴(kuò)大培養(yǎng)體積，比活力可達(dá)15 U/mg，活力提高了5倍左右。

腈水解酶；敏捷食酸菌；大腸桿菌；克隆

腈水解酶（EC 3.5.5.1，Nitrilase）是一類催化腈類物質(zhì)水解的特異性酶，屬于腈水解酶超家族［1］。該酶兼具有腈水合酶（EC 4.2.1.84，nitrile hydratase）催化腈類水解成酰胺，以及酰胺水解酶（EC 3.5.1.4，amidase）催化酰胺水解成羧酸和氨兩種功能，它能直接催化腈類物質(zhì)水解成相應(yīng)的羧酸并釋放出氨氣［2］。

腈水解酶的水解反應(yīng)機(jī)制（圖1），酶促反應(yīng)的中心是一個(gè)半胱氨酸殘基，半胱氨酸巰基的強(qiáng)親核性使得整個(gè)酶促反應(yīng)類似于堿條件下的酸堿催化，整個(gè)反應(yīng)包含了兩分子的水的結(jié)合與一分子氨氣的脫離［3］。腈水解酶的活性不受大多數(shù)金屬離子和螯合劑的影響，但Ag+和Hg+等重金屬離子能和巰基作用，對(duì)酶的活性有較大影響，這證明了半胱氨酸的巰基在反應(yīng)中的重要作用。Brenner等［4］根據(jù)蠕蟲(chóng)的NitFhit的晶體結(jié)構(gòu)分析，認(rèn)為腈水解酶一族的催化活性中性，是一個(gè)含谷氨酸-賴氨酸-半胱氨酸（Glu-Lys-Cys）的脆性催化三聯(lián)體（catalytic triad）。

圖1 腈水解酶（a）與腈水合酶酰胺水解酶（b）催化底物水解機(jī)制

由于腈水解酶具有高度的區(qū)域以及立體選擇性，使得該酶在化工和藥物合成等領(lǐng)域越來(lái)越受關(guān)注［5］。腈水解酶的作用底物主要分為以下幾類：脂肪和芳香族脂肪腈，芳香腈，脂環(huán)和雜環(huán)腈，二腈等腈類化合物。例如，研究脂肪和芳香族脂肪腈水解，用于乙醇酸的生產(chǎn)［6，7］；以芳腈作為底物時(shí)，萘普生、布洛芬和氟比洛芬等α-芳基丙酸化合物以及R-扁桃酸的生產(chǎn)［8］；脂環(huán)和雜環(huán)類的腈轉(zhuǎn)化，比較有特色的是利用紅球菌屬實(shí)現(xiàn)煙酸的生產(chǎn)以及有關(guān)擬南芥的腈水解酶用于合成吲哚-3-乙酸的研究［9］；二腈的選擇性水解比較代表性的是，普瑞巴林合成過(guò)程中手性中間體的生產(chǎn)［10］。

目前該酶的研究主要集中在國(guó)外，國(guó)內(nèi)有關(guān)研究還處于較落后階段，有關(guān)雙腈的選擇性催化水解的文章基本較少，亟待篩選高產(chǎn)該類酶的菌株或通過(guò)基因手段構(gòu)建相關(guān)的工程菌［11］，Acidovorax facilis ATCC 55746是目前報(bào)道的選擇性水解雙腈活力突出的菌株［12］。本研究選用在大腸桿菌中有高表現(xiàn)的pET系統(tǒng)，構(gòu)建pET-Nit重組質(zhì)粒，實(shí)現(xiàn)成功誘導(dǎo)表達(dá)，并對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酶的誘導(dǎo)相關(guān)條件進(jìn)行系列優(yōu)化，優(yōu)化后酶產(chǎn)量提高了5倍，能達(dá)到產(chǎn)酶的先進(jìn)水平。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒 表達(dá)質(zhì)粒pET-28a和表達(dá)宿主E.coli Rosetta（DE3）由本實(shí)驗(yàn)室自主保藏；敏捷食酸菌腈水解酶基因片段由上海生物工程公司合成（基因克隆在PUC57質(zhì)粒上，插入位點(diǎn)為BamH I）。

1.1.2 主要試劑 異丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）購(gòu)自BioDev公司；限制性內(nèi)切酶Nde I，Sal I，DL15000 DNA Maker，Solution I高效連接酶等購(gòu)自TaKaRa公司；小量質(zhì)粒提取和膠回收試劑盒購(gòu)自AXYGEN公司；PCR引物由金斯瑞合成；其余試劑為國(guó)產(chǎn)或者進(jìn)口分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基 LB培養(yǎng)基（g/L）：胰蛋白胨10，酵母粉5，氯化鈉10（固體平板加入瓊脂粉20）。SOC培養(yǎng)基（g/L）：20胰蛋白胨，5酵母粉，0.5氯化鈉，0.2 氯化鉀，0.94氯化鎂，1.6葡萄糖。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)和腈水解酶的克隆 根據(jù)敏捷食酸菌ATCC 55746腈水解酶基因序列（GenBank 登錄號(hào)為DQ444267.1），設(shè)計(jì)上下游擴(kuò)增引物：P1：5'-GCTCATATGGTTTCGTATAACAGCAAGTTCCTCG -3'；P2：5'-GGTGTCGACCTTTGCTGGGACCGGTTCTT-3'。在上下游引物分別引入Nde I和Sal I酶切位點(diǎn)（下劃線部分），將原始基因的起始密碼子GTG改為大腸優(yōu)選的ATG，去除末端的終止密碼子使得表達(dá)蛋白帶上純化標(biāo)簽，并同時(shí)在引物前方加入3個(gè)bp的保護(hù)堿基。預(yù)計(jì)擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度約為1 080 bp的基因片段。引物由金斯瑞（南京）公司合成。

提取含有敏捷食酸菌腈水解酶基因的質(zhì)粒作為擴(kuò)增模板，利用上述引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件為：蓋溫99℃，94℃預(yù)變性5 min，94℃變性45 s，56℃退火45 s，72℃延伸2 min，工作時(shí)間30個(gè)循環(huán)。

1.2.2 重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建和測(cè)序?qū)Ρ?PCR產(chǎn)物與質(zhì)粒pET-28a使用Nde I/Sal I內(nèi)切酶雙酶切過(guò)夜，膠回收酶切產(chǎn)物。將純化的目的基因片段和線性化載體按適當(dāng)比例，用Solution I高效連接酶連接過(guò)夜，使用氯化鈣轉(zhuǎn)化法進(jìn)行感受態(tài)轉(zhuǎn)化。篩選陽(yáng)性重組子，培養(yǎng)和提取質(zhì)粒進(jìn)行PCR驗(yàn)證與測(cè)序。經(jīng)鑒定正確的重組質(zhì)粒命名為pET-Nit。通過(guò)Blast對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行對(duì)比分析。

1.2.3 腈水解酶酶液的提取 挑取重組大腸桿菌E.coli Rosetta（DE3）/pET-Nit單菌落，接種到含有50 mg/L硫酸卡那霉素的5 mL的 LB液體培養(yǎng)基中，37℃，250 r/min過(guò)夜培養(yǎng)后，按1%接種量接種到新鮮的含有50 mg/L硫酸卡那霉素的50 mL 的LB液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)3 h后，加入IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。

菌液冷凍離心（4℃，8 000 r/min，20 min），棄去上清，沉淀使用磷酸鉀緩沖液清洗（pH7.0，100 mmol/L的濃度）兩次后，超聲破碎（功率300 W，超聲3 s，間隔5 s，工作時(shí)間3 min），超聲后菌液冷凍離心（4℃，8 000 r/min，20 min）。棄去沉淀取上清液測(cè)定酶活力。

1.2.4 SDS-PAGE分析 取方法1.2.3中的酶液進(jìn)行SDS-PAGE分析。采用12.5%的分離膠和4%的濃縮膠制膠，電泳后使用考馬斯亮藍(lán)R-250進(jìn)行染色。以原始宿主菌和未經(jīng)誘導(dǎo)的重組菌株的破碎上清作為對(duì)照。

1.2.5 腈水解酶活力測(cè)定 酶活力測(cè)定使用苯酚硫酸鹽顯色法，顯色液與標(biāo)準(zhǔn)液的制備方法如文獻(xiàn)［13］所述。取酶液20 μL，加入到10 mL含有100 mmol/L最適底物反丁烯二腈的磷酸鉀緩沖液（pH7.0，100 mmol/L）中（反丁烯二腈使用N，N-二甲基甲酰胺當(dāng)助溶劑，終濃度為5%），酶促反應(yīng) 30 min后取出使用硫酸銨作為標(biāo)準(zhǔn)樣，測(cè)定銨根離子的濃度。一個(gè)酶活力單位（U）定義為：每分鐘能催化1 μmol底物水解所需的酶量。

蛋白質(zhì)含量測(cè)定使用Brandford法［14］，以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)樣。腈水解酶比活力定義為：每毫克蛋白所具有的酶活單位數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 Nit基因的克隆與分析

擴(kuò)增腈水解酶基因，PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)（圖2），在1 080 bp左右具有很清晰的條帶，與預(yù)期設(shè)計(jì)一致。提取質(zhì)粒對(duì)目的基因測(cè)序分析，目的片段與GenBank所報(bào)道的基因相似性為99%，在酶讀碼框的第996和1 032位的堿基G和A發(fā)生突變分別突變?yōu)門和G，對(duì)應(yīng)的332和343位的氨基酸仍然是纈氨酸和谷氨酸，并不影響酶的表達(dá)和性質(zhì)。

圖2 目的片段PCR擴(kuò)增

2.2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建和表達(dá)

構(gòu)建的表達(dá)質(zhì)粒經(jīng)Nde I/Sal I雙酶切鑒定（圖3），pET-Nit在1 080 bp左右比空載體明顯多出一個(gè)條帶，與插入目的基因大小相同，表明片段已經(jīng)成功插入，重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

圖3 pET-Nit重組質(zhì)粒雙酶切驗(yàn)證

2.3 腈水解酶的誘導(dǎo)表達(dá)和SDS-PAGE分析

重組菌pET-Nit/Rosetta（DE3）經(jīng)過(guò)0.2 mmol/L的IPTG在30℃誘導(dǎo)表達(dá)12 h后，腈水解酶比酶活為3 U/mg，而空宿主不具備酶活，未誘導(dǎo)的重組菌表達(dá)量幾乎為零。SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示（圖4），重組菌株經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)后在41.28 kD處有明顯的融合條帶，與預(yù)期的判斷一致，出發(fā)菌和未誘導(dǎo)的在該區(qū)域不具有明顯條帶。根據(jù)酶活測(cè)定和SDS-GAGE結(jié)果顯示，腈水解酶Nit已經(jīng)在重組大腸桿菌中成功表達(dá)。

2.4 誘導(dǎo)條件優(yōu)化

通過(guò)對(duì)誘導(dǎo)溫度，誘導(dǎo)物濃度和誘導(dǎo)時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化，找到了工程菌的最佳產(chǎn)酶條件。

2.4.1 誘導(dǎo)溫度優(yōu)化 加入IPTG后分別在20、25、30、35和40℃下進(jìn)行誘導(dǎo)，時(shí)間為12 h，結(jié)果顯示（圖5）低溫時(shí)候比酶活更高，這表明低溫有助于酶的正確折疊，不易形成包涵體，但是溫度過(guò)低，對(duì)菌體生長(zhǎng)速度有限制［15］。

圖4 pET-Nit SDS-PAGE 電泳圖譜（全細(xì)胞蛋白）

圖5 誘導(dǎo)溫度優(yōu)化

2.4.2 IPTG濃度的優(yōu)化 分別加入0.05、0.1、0.2、0.4、0.8及1.2 mmol/L終濃度的IPTG，25℃誘導(dǎo)表達(dá)12 h。結(jié)果（圖6）顯示，加入量為0.2 mmol/L IPTG時(shí)菌體密度最佳，并且比酶活最高，為15 U/mg。IPTG濃度過(guò)小，表達(dá)量和菌體濃度都不夠，而IPTG濃度過(guò)大菌體量和酶活力反而下降，這表明不能為菌體代謝的高濃度的IPTG會(huì)抑制菌體生長(zhǎng)。2.4.3 IPTG誘導(dǎo)時(shí)間優(yōu)化 加入IPTG至終濃度為0.2 mmol/L，25℃分別誘導(dǎo)4、8、12、16、20和24 h。如圖7所示，加入誘導(dǎo)16 h左右的比酶活達(dá)到最高值，之后酶活變化幅度很小。這表明到達(dá)一定的表達(dá)量以后，再過(guò)量的外源酶蛋白會(huì)對(duì)菌體產(chǎn)生負(fù)荷，部分會(huì)被菌體所水解，過(guò)度延長(zhǎng)誘導(dǎo)時(shí)間不具實(shí)用意義［16］。

圖6 IPTG濃度的優(yōu)化

圖7 誘導(dǎo)時(shí)間優(yōu)化

經(jīng)過(guò)一系列的優(yōu)化后，在200 mL裝液量的搖瓶中放大培養(yǎng)，使用25℃培養(yǎng)溫度，終濃度為0.2 mmol/的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)16 h，重組菌的活力可達(dá)到15 U/mg，比優(yōu)化前提高了5倍。

3 討論

腈水解酶在醫(yī)藥、化工和有機(jī)合成等方面具有十分廣泛的應(yīng)用，目前國(guó)內(nèi)有關(guān)該方面的研究還處在較落后水平，且有關(guān)研究還多集中在扁桃酸、煙酸等一些比較基礎(chǔ)的研究層面［17］，有關(guān)化學(xué)選擇性和立體選擇性相結(jié)合的腈水解酶篩選更是鮮有耳聞，有關(guān)的酶蛋白克隆表達(dá)和分子改造等相關(guān)研究較少。在國(guó)外特別是歐洲和美國(guó)等國(guó)家，有關(guān)研究可追溯到20世紀(jì)80到90年代［18］。

pET表達(dá)系統(tǒng)具有乳糖誘導(dǎo)性能，通過(guò)α互補(bǔ)作用，含有該質(zhì)粒菌株能利用乳糖的類似物IPTG來(lái)高表達(dá)目的蛋白［19，20］。雖然有敏捷食酸菌的腈水解酶基因克隆的相關(guān)報(bào)道［21］，但有關(guān)誘導(dǎo)表達(dá)和產(chǎn)酶的優(yōu)化研究還未見(jiàn)報(bào)道。本研究切除了基因自帶的啟動(dòng)子，采用pET-28自帶的T7強(qiáng)啟動(dòng)子對(duì)其進(jìn)行表達(dá)，選擇了能利于稀有密碼子表達(dá)的大腸桿菌Rosetta株作為宿主菌。在優(yōu)化了一系列表達(dá)條件下，酶的表達(dá)量和活力均有提高，而質(zhì)粒所帶的His-tag標(biāo)簽對(duì)于蛋白純化十分有利。在酶活測(cè)定方面，本試驗(yàn)測(cè)量量化到了毫克比酶活，并使用苯酚硫酸鹽顯色法，測(cè)定更加快捷和精確，有助于研究轉(zhuǎn)化反應(yīng)酶用量的控制。具有化學(xué)選擇性的脂肪族腈水解酶工程菌的成功構(gòu)建，為使用該菌株催化相關(guān)底物的研究，以及相關(guān)分子改造奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本研究以具有化學(xué)選擇的敏捷食酸菌腈水解酶DNA作為模板，PCR擴(kuò)增獲得目的片段，測(cè)序驗(yàn)證所克隆的目的片段，選用pET-28a質(zhì)粒作為表達(dá)載體構(gòu)建表達(dá)重組質(zhì)粒并轉(zhuǎn)化。對(duì)重組菌株進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，優(yōu)化誘導(dǎo)條件，結(jié)果顯示經(jīng)過(guò)優(yōu)化后比酶活大幅度提高，優(yōu)化后的酶比活力高達(dá)15 U/mg，比未優(yōu)化的提高了5倍。

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（責(zé)任編輯 李楠）

Expression of Nitrilase Gene from Acidovorax facilis in Escherichia coli

Guan Qiwang Ma Jiangfeng He Aiyong Jiang Min Gong Changbin
（State Key Laboratory of Materials-Oriented Chemical Engineering，College of Biotechnology and Pharmaceutical Engineering，Nanjing Tech University，Nanjing 211816）

Plasmid containing Acidovorax facilis gene， was used as a template， and length of 1 080 bp nitrilase（Nitrilase）gene fragment was obtained by PCR. Expressed genes were sequenced and compared to gene sequences found in GenBank. There are 2 bp mutation was found， which can not affect the expression and characterization of the enzyme. The recombinant plasmid was transformed into the Escherichia coli Rosetta（DE3）competent cell， which was induced IPTG for strain- expression. SDS-PAGE analysis was used and showed that the protein molecular weight was about 41.28 kD. Enzyme activity analysis showed that the specific activity of the supernatant was 3 U/mg. Induction conditions were optimized， including induction temperature， IPTG concentration， induction time and a series of conditions. Under optimal conditions and with the expansion of the culture volume， the specific activity can up to 15 U/mg， and activity increased by about five times.

nitrilase；Acidovorax facilis；Escherichia coli；clone

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.01.027

2014-06-12

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（21076105），國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃（“973”計(jì)劃）（2009CB724701），江蘇高校優(yōu)勢(shì)學(xué)科建設(shè)工程項(xiàng)目

管啟旺，男，碩士，研究方向：工業(yè)微生物；E-mail：819468208@qq.com

馬江鋒；E-mail：bioengine@njut.edu.cn