高效液相色譜法研究甲氨蝶呤和特立氟胺在大鼠體內的藥代動力學

楊國韜，蘭 艷

（1. 黃石市中心醫院（湖北理工學院附屬醫院），湖北 黃石 435000； 2. 腎臟疾病發生與干預湖北省重點實驗室，湖北 黃石 435000）

高效液相色譜法研究甲氨蝶呤和特立氟胺在大鼠體內的藥代動力學

楊國韜1，2，蘭 艷1，2

（1. 黃石市中心醫院（湖北理工學院附屬醫院），湖北 黃石 435000； 2. 腎臟疾病發生與干預湖北省重點實驗室，湖北 黃石 435000）

采用高效液相色譜法（HPLC）建立大鼠血漿中的甲氨蝶呤（MTX）和特立氟胺（TEF）的檢測方法，研究大鼠體內MTX和TEF的藥代動力學。色譜柱為Aglient ZORBAX SB-C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：50 mM 乙酸鈉溶液—乙腈（體積比85:15）；檢測波長為300 nm；柱溫為30 ℃；流速為1.5 mL/min。大鼠采用靜脈注射給藥，藥動學參數采用DAS 2.0計算。該HPLC方法可用于大鼠血漿中MTX和TEF的同時測定，方法準確，快速，靈敏度高，重復性好，適用于大鼠體內MTX和TEF藥物代謝動力學的研究。

高效液相色譜法；甲氨蝶呤；特立氟胺；大鼠；藥代動力學

類風濕性關節炎（RA）是一種慢性的多系統的具有侵蝕性的自身免疫性疾病，臨床主要表現為對稱性多關節炎，其癥狀多見關節腫痛、功能障礙、關節僵硬和畸形，最終可導致殘疾。其發病機制尚不明確，嚴重威脅著人類健康［1，2］。目前，臨床上經常采用甲氨蝶呤（MTX）和來氟米特（LEF）聯合用藥的方式來對RA進行治療［3］。MTX為常用藥物，不良反應較多，難以長時間持續使用，而來氟米特（LEF）是一種相對高效低毒的新型抗炎和免疫調節抗RA藥物臨床療效顯著［4］。本品為前藥，其進入體內后在腸和肝中代謝成為活性產物特立氟胺（TEF），后者可抑制嘧啶核苷合成所需的二氫乳清酸脫氫酶。大多數研究都采用監測TEF的方法，來評價LEF療效及作用特點［4］。因此本文選擇MTX和TEF作為研究對象。

本文擬通過HPLC法建立大鼠血漿中MTX和TEF濃度檢測方法，并探討MTX和TEF在大鼠體內的藥代動力學特點［5，6］。通過該研究可對進一步評價MTX和TEF聯合應用治療類風濕性關節炎的作用機理，對藥物的安全應用具有重要意義。

1 實驗部分

1.1 動物

普通級雄性SD大鼠6只，體質量（200±20）g，購自北京維通利華動物實驗中心，實驗動物合格證號為SCXK（京）2010-0016。

1.2 藥品與試劑

甲氨蝶呤（浙江海正藥業股份有限公司，國藥準字H20055198）；特立氟胺（湖北恒綠源科技有限公司）；乙腈、甲醇（色譜純，美國Fisher Scientific公司）；乙酸鈉（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）；水為純凈水。

1.3 儀器

日立 L-7000型高效液相色譜系統，配有L-7110 型泵，L-7200 型自動進樣器，L-7420 型UV檢測器； Sigma 3K15 高速低溫離心機（Sigma公司）；DCY-24S水浴式氮吹儀（青島海科儀器有限公司）；BS110S型電子天平（賽多利斯科學儀器（北京）有限公司）；XW-80A 旋渦混合器（上海青浦滬西儀器廠）；KQ 500DE型數控超聲波清潔器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.4 方法

1.4.1 色譜條件

色譜柱為Aglient ZORBAX SB-C18柱（4.6 mm ×250 mm，5 μm）；流動相：50 mM 乙酸鈉溶液—乙腈（體積比85:15）；檢測波長為300 nm；柱溫為30 ℃；流速為1.5 mL/min。

1.4.2 標準曲線的配制

精密秤取 MTX對照品適量，用稀鹽酸溶解后加純凈水稀釋至刻度，配制成400 μg/mL貯備液；精密秤取TEF對照品適量，用甲醇溶解并定容，配制成400 μg/mL貯備液。臨用前將兩個儲備液等量混合，用甲醇逐級稀釋，配制成MTX和TEF濃度均為2.0、5.0、10、20、100、和200 μg/mL的系列標準溶液。再分別取標準系列溶液10 μL加入到90 μL空白大鼠血漿中，使血漿中MTX和TEF濃度均為0.2、0.5、1.0、2.0、10、和20 μg/mL。配制過程注意避光。

1.4.3 血漿樣品處理

取大鼠血漿樣品0.1 mL，加入沉淀劑（乙腈：甲醇1∶1）0.6 mL，充分渦旋振蕩1 min，1 4000 r/min離心10 min，取上清0.5 mL置1.5 mL離心管中，氮氣吹干，取0.1 mL流動相復溶，進樣50 μL進行分析。

1.4.4 大鼠藥動學

6只雄性大鼠適應性飼養7 d，實驗前一天至少禁食12 h，給藥前將MTX和TEF混合，尾靜脈注射給藥。MTX和TEF的給藥劑量分別為2 mg/kg和1 mg/kg。分別于給藥前和給藥后0.083、0.5、1、2、4、8、12和24 h眼球靜脈叢取血0.3 mL置于肝素化的離心管中。3 000 r/min離心15 min，取血漿-30℃保存備用。

1.4.5 數據處理

采用DAS 2.0軟件計算藥代動力學參數，計數資料以mean ± SD表示， Origin 8.0繪制藥物血漿濃度-時間曲線。

2 結果與討論

2.1 方法學驗證

在上述色譜條件下，MTX和TEF的保留時間分別為6.52 和8.75 min。空白血漿、空白血漿中加入MTX和TEF標準溶液及靜注給藥后大鼠血漿色譜圖（圖 1）表明在該色譜條件下，空白基質中的雜質不干擾MTX和TEF的測定。

以MTX濃度（X）為橫坐標，MTX峰面積（Y）為縱坐標，做線性回歸，得相應的回歸方程 Y = 146.31X -119.65，r = 0. 9952，顯示MTX血藥濃度在0.2～20 μg/mL的范圍內呈現良好的線性關系。定量下限為0.2 μg/mL。以TEF濃度（X）為橫坐標，TEF峰面積（Y）為縱坐標，做線性回歸，得相應的回歸方程Y = 216.48X +88.32，r = 0. 9964，顯示TEF血藥濃度在0.2～20 μg/mL的范圍內呈現良好的線性關系。定量下限為0.2 μg/mL。

低、中、高三個濃度MTX和TEF樣品（0.2、2.0和20 μg/mL）的日內RSD和日間RSD均小于10%，回收率和準確度在85%～115%之間（表1和表2）。MTX和TEF樣品在室溫放置6 h和進樣倉放置24 h條件下保持穩定（表3）。方法學驗證結果顯示該方法符合生物樣品分析要求。

圖1 大鼠血漿色譜圖Fig.1 Chromatograms for rat plasma

表1 大鼠血漿中MTX測定方法的回收率、精密度和準確度Table 1 Recovery， precision and accuracy of the assay method for MTX in rat plasma （n= 5）

表2 大鼠血漿中TEF測定方法的回收率、精密度和準確度Table 2 Recovery， precision and accuracy of the assay method for TEF in rat plasma （n= 5）

表3 大鼠血漿中MTX和TEF的穩定性Table 3 Stability of MTX and TEF in rat plasma （mean±SD，n=5）

2.2 大鼠藥動學

大鼠尾靜脈注射MTX和TEF后的藥物血漿濃度-時間曲線和主要的藥代動力學參數分別見圖 2和表4。

表4 大鼠靜注MTX和TEF后的主要藥代動力學參數Table 4 Pharmacokinetic parameters of MTX and TEF after iv administration in rats （mean ± SD， n=6）

3 結 論

本文建立的HPLC方法準確，快速，靈敏度高，重復性好，能夠對大鼠血漿中MTX和TEF的濃度進行同時測定，適用于大鼠體內MTX和TEF藥物代謝動力學的研究以及其它方面的代謝及藥動學研究。

本研究得出 MTX的主要藥動參數為Cmax為（3627.46 ± 472.16）ng/mL，t1/2z為（2.54 ± 0.23）h，AUC為（6233.42 ± 703.70）ng·h/mL，MRT 為（2.26 ± 0. 35）h，CLz為（0.18 ± 0.02）h。TEF的主要藥動參數為Cmax為（12036.42 ± 1736.53）ng/mL，t1/2z為（18. 43 ± 1.67）h，AUC為（156397.33 ± 9913.84）ng·h/mL，MRT 為（16.56 ± 1.49）h，CLz為（0.035 ± 0.002）h。

圖2 MTX和TEF在大鼠體內的藥時曲線Fig.2 The mean concentration-time curves of MTX and TEF in rats （mean ± SD， n=6）

［1］ 鐘南山，陸再英.內科學［M］.第7版.北京：人民衛生出版社，2009：848-851.

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Pharmacokinetic Research of Methotrexate and Teriflunomide in Rats by HPLC

YANG Guo-tao1，2， LAN Yan1，2
（1. Department of Pharmacy， Huangshi Central Hospital， Affiliated Hospital of Hubei Polytechnic University， Hubei Huangshi 435000， China； 2. Hubei Key Laboratory of Kidney Disease Pathogenesis and Intervention， Hubei Huangshi 435000， China）

A HPLC method was established for determination of plasma concentration of methotrexate and teriflunomide and study on the pharmacokinetics of methotrexate and teriflunomide in rats. The chromatographic conditions were as follows： a Aglient ZORBAX SB-C18 chromatographic column （250 mm × 4.6 mm， 5 μm） was used at 30 ℃. The mobile phase consisted of 50 mM sodium acetate solution-acetonitrile （85：15， v/v） and was pumped at a flow rate of 1.5 mL·min-1. The determination wavelength was 300 nm. Rats were received a single dose of drugs by intravenous injection. The pharmacokinetic parameters of methotrexate and teriflunomide were calculated with DAS 2.0 software. The HPLC method for determining methotrexate and teriflunomide concentration in rat plasma is accurate， rapid， simple， sensitive and repeatability and can be applied to pharmacokinetic studies of methotrexate and teriflunomide.

HPLC； Methotrexate； Teriflunomide； Rats； Pharmacokinetics

TQ 460

A

1671-0460（2015）12-2916-03

2015-08-06

楊國韜（1977-），男，湖北黃石人，主管藥師，1995年畢業于黃石衛校藥劑專業，研究方向：從事臨床藥學工作。

蘭艷（1986-），女，初級藥師，研究方向：ICU臨床藥師。E-mail： yanlan86@hotmail.com。