紅樹林真菌PH1008胞外多糖增強(qiáng)小鼠免疫功能的研究

王英，貝寧，王永霞，裴華，*，楊文，饒朗毓

（1.中南大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，湖南長沙410013；2.海南醫(yī)學(xué)院熱帶醫(yī)學(xué)與檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院，海南海口571199；3.海南省老年病醫(yī)院，海南海口571100）

紅樹林真菌PH1008胞外多糖增強(qiáng)小鼠免疫功能的研究

王英1，2，貝寧3，王永霞2，裴華2，*，楊文2，饒朗毓2

（1.中南大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，湖南長沙410013；2.海南醫(yī)學(xué)院熱帶醫(yī)學(xué)與檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院，海南海口571199；3.海南省老年病醫(yī)院，海南海口571100）

研究一株分離自紅樹林真菌PH1008胞外多糖（exopolysaccharide，EPS）對(duì)小鼠免疫功能的影響，評(píng)價(jià)其在免疫功能方面的應(yīng)用價(jià)值。體外實(shí)驗(yàn)采用四甲基偶氮唑鹽（MTT）法檢測(cè)該菌胞外多糖對(duì)小鼠脾細(xì)胞增殖的刺激作用和觀察其對(duì)小鼠NK細(xì)胞殺傷活性的影響；體內(nèi)實(shí)驗(yàn)以三組不同劑量EPS連續(xù)小鼠灌胃28 d后，進(jìn)行臟體指數(shù)測(cè)定。分離自海南紅樹林的真菌PH1008胞外多糖在體外能刺激小鼠脾細(xì)胞增殖，具有促進(jìn)NK細(xì)胞殺傷K526細(xì)胞的能力；增加小鼠臟體指數(shù)，增強(qiáng)固有免疫功能。產(chǎn)自海南紅樹林的真菌PH1008初步鑒定為近平滑假絲酵母菌，其胞外多糖具有增強(qiáng)小鼠免疫功能。

紅樹林真菌；胞外多糖；脾細(xì)胞；NK細(xì)胞

紅樹林是海岸潮間帶特有的植被，生態(tài)環(huán)境特殊，有著豐富而獨(dú)特的微生物類群，目前已分離鑒定的紅樹林真菌超過200種，成為海洋真菌的第二大類群。該環(huán)境中的真菌因其生態(tài)環(huán)境的特殊，可能存在大量具有獨(dú)特生物學(xué)功能的代謝產(chǎn)物［1］。菌株P(guān)H1008是從海南省東寨港紅樹林國家自然保護(hù)區(qū)土壤中分離得到的一株真菌，經(jīng)初步鑒定為近平滑假絲酵母菌，本實(shí)驗(yàn)初步研究了其對(duì)小鼠免疫功能的影響，現(xiàn)報(bào)告如下。

1材料和方法

1.1試劑和培養(yǎng)基

PH1008真菌胞外多糖由本課題組提取；香菇多糖（南京康海藥業(yè)有限公司，國藥準(zhǔn)字H10950078），K526細(xì)胞：上海雅吉生物科技有限公司；胎牛血清：杭州四季青公司；RPMI-1640培養(yǎng)基：Gibco公司；ConA：Sigma公司；其余試劑均為分析純。

發(fā)酵培養(yǎng)基采用大豆粉玉米粉培養(yǎng)基（大豆粉10 g，玉米粉10 g，可溶性淀粉5 g，KH2PO40.5 g，50%陳海水定容至1 L，調(diào)pH 7.2）；細(xì)胞培養(yǎng)基：含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

BALB/c品系小鼠，8～10周齡，購自長沙市天勤生物技術(shù)有限公司。

1.3方法［2-5］

1.3.1真菌胞外多糖的獲取

PH1008真菌活化二代后，接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，經(jīng)搖床培養(yǎng)發(fā)酵5 d后，收集發(fā)酵液離心取上清。發(fā)酵上清液離心后，用冰乙醇4℃沉淀24 h，4℃條件下離心后，沉淀溶于去離子水中。鏈蛋白酶+Sevag法聯(lián)合脫蛋白后，-50℃條件下凍干48 h后備用。

1.3.2EPS對(duì)小鼠脾細(xì)胞增殖的刺激作用

取5只BALB/c小鼠脫頸椎處死，無菌條件下取脾組織剪成塊狀，浸入Hank's液中，研缽反復(fù)研磨成勻漿，用200目篩網(wǎng)過濾，收集脾細(xì)胞懸液低速離心，棄上清，Hank's液洗滌2次。用含20%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度至5×104/mL，加入細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔100 μL，分別加入相應(yīng)濃度實(shí)驗(yàn)藥物100 μL（設(shè)3藥物濃度：200、100、50 μg/mL），每一實(shí)驗(yàn)藥物濃度設(shè)5個(gè)重復(fù)孔，5%CO2培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)44 h。吸出孔中培養(yǎng)液100 μL棄去，分別加入5 mg/mL濃度的MTT20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，分別于每孔加入150 μL二甲基亞砜，搖床低速振蕩，使結(jié)晶物充分溶解，測(cè)吸光度值A(chǔ)490nm。同時(shí)設(shè)置實(shí)驗(yàn)對(duì)照孔和空白調(diào)零孔。

1.3.3EPS對(duì)小鼠NK細(xì)胞殺傷K526細(xì)胞的影響

用完全1640培養(yǎng)基將靶細(xì)胞K526細(xì)胞濃度為1×105/mL，小鼠脾細(xì)胞懸液濃度調(diào)為2×106/mL，分別吸取50 μL加入細(xì)胞培養(yǎng)板，使K526細(xì)胞：脾細(xì)胞之比為1∶20，在此基礎(chǔ)上分別加入相應(yīng)試驗(yàn)藥物50 μL（設(shè)3個(gè)終濃度：150、100、50μg/mL）。EPS組加入EPS，香菇多糖組加入香菇多糖，同時(shí)設(shè)脾細(xì)胞對(duì)照、K526細(xì)胞對(duì)照和空白對(duì)照，5%CO2培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)48 h后，分別于每孔加入MTT15 μL，續(xù)培養(yǎng)4 h后吸出上清，再分別加入150 μL二甲基亞砜，測(cè)吸光度值A(chǔ)570nm，計(jì)算NK細(xì)胞殺傷活性。

1.3.4EPS對(duì)小鼠臟體指數(shù)的影響

以BALB/c品系小鼠進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，評(píng)估胞外多糖對(duì)動(dòng)物免疫功能影響。隨機(jī)將小鼠分為3組，雌雄隨機(jī)，每組15只，采用灌胃方式給予劑量1 mL實(shí)驗(yàn)藥物。實(shí)驗(yàn)組給予磷酸鹽緩沖液（PBS）溶解胞外多糖凍干粉末（50 mg/kg）溶液；陽性對(duì)照組給予PBS溶解香菇多糖（50 mg/kg）溶液；正常對(duì)照組給予PBS；1次/d，連續(xù)28 d。第28天給藥后，12 h禁食不禁水，分別稱體重，脫頸椎處死后剝離胸腺、脾臟、肝臟用濾紙吸去多余的血水稱重，并計(jì)算胸腺/體重比值和脾臟/體重比值。

1.3.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2結(jié)果

2.1EPS對(duì)小鼠脾細(xì)胞增殖的影響

EPS組與香菇多糖組和對(duì)照組相比，P均<0.01，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，EPS組各濃度組間比較P<0.01，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表1。

表1　EPS對(duì)小鼠脾細(xì)胞增殖的影響（±s）Table 1Effect of EPS on the Proliferation of Mouse Spleen Cells（±s）

表1　EPS對(duì)小鼠脾細(xì)胞增殖的影響（±s）Table 1Effect of EPS on the Proliferation of Mouse Spleen Cells（±s）

注：#EPS組與對(duì)照組比較，P<0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，組間比較，P< 0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。*EPS組與香菇多糖組比較，P<0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

組別終濃度/（μg/mL）吸光度值（A）EPS組#2000.566±0.032 1000.350±0.029 500.266±0.038香菇多糖組*2000.350±0.016 1000.232±0.019 500.170±0.016對(duì)照組—0.120±0.010

2.2EPS對(duì)小鼠NK細(xì)胞殺傷K526細(xì)胞的影響

EPS實(shí)驗(yàn)濃度組均能增強(qiáng)NK細(xì)胞殺傷活性，見表2。

表2　EPS對(duì)小鼠NK細(xì)胞殺傷K526細(xì)胞的影響Table 2Effect of EPS on the indices of organs in Mice

2.3EPS對(duì)小鼠臟體指數(shù)的影響

菌株P(guān)H1008所產(chǎn)生的EPS于小鼠連續(xù)灌胃28 d后，與正常對(duì)照組相比，小鼠的胸腺/體重、脾臟/體重、肝臟/體重的臟體指數(shù)有顯著性提高（P<0.01），見表3。

表3　EPS對(duì)小鼠臟體指數(shù)的影響（±s）Table 3Effect of EPS on the Proliferation of Mouse Spleen Cells（±s）

表3　EPS對(duì)小鼠臟體指數(shù)的影響（±s）Table 3Effect of EPS on the Proliferation of Mouse Spleen Cells（±s）

注：#與PBS組比較，P<0.01，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；*組間比較，P< 0.01，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

肝臟指數(shù)/（mg/g）PBS組03.56±0.155.78±0.1859.98±0.17香菇多糖組504.47±0.14#7.43±0.17#62.16±0.23# EPS組254.28±0.17#6.34±0.21#61.96±0.21#* EPS組504.64±0.17#7.63±0.17#63.00±0.21#* EPS組1004.92±0.06#7.91±0.13#63.52±0.23#*組別劑量/（mg/kg）胸腺指數(shù)/（mg/g）脾臟指數(shù)/（mg/g）

3討論

胞外多糖（exopolysaccharide，EPS）是微生物在生長代謝過程中分泌到細(xì)胞壁外形成的易與菌體分離的可溶性多糖及多糖復(fù)合物，是微生物的具有多種生物活性的次級(jí)代謝產(chǎn)物［6］，近年來已成為大多學(xué)者的研究熱點(diǎn)。目前，國內(nèi)外研究也均證實(shí)胞外多糖具有多種免疫學(xué)功能［7-9］。海南紅樹林生長在熱帶、亞熱帶低能海岸潮間帶上部，生長環(huán)境特殊，資源豐富，生活在其中的微生物其代謝產(chǎn)物也可能具有獨(dú)特的生物學(xué)活性，因此對(duì)紅樹林微生物及其代謝產(chǎn)物的研究正逐漸受到人們的關(guān)注［10］。

本課題組從海南紅樹林中分離獲得一株真菌PH1008，初步鑒定為近平滑假絲酵母菌，通過本次實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，該菌株所產(chǎn)生的胞外多糖與對(duì)照組和香菇多糖組相比，各濃度EPS組均能顯著刺激小鼠脾細(xì)胞增殖和促進(jìn)小鼠NK細(xì)胞殺傷K526細(xì)胞能力，并隨著多糖濃度的增加而有增強(qiáng)效應(yīng)，表現(xiàn)出劑量效應(yīng)關(guān)系。動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，用不同劑量胞外多糖在連續(xù)灌胃小鼠后，對(duì)于小鼠臟體指數(shù)有較為顯著的增強(qiáng)效應(yīng)，且不同劑量組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。由此可見，該菌株P(guān)H1008胞外多糖能明顯增強(qiáng)小鼠機(jī)體的免疫功能。

本次研究的實(shí)驗(yàn)菌株分離自海南紅樹林，隨著紅樹林微生物資源的開發(fā)利用和基因工程等技術(shù)的普及，對(duì)該菌株生物學(xué)性狀、代謝途徑和代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)的進(jìn)一步研究，有助于開發(fā)該菌株相應(yīng)的保健食品并為其開發(fā)提供理論參考。

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Study on EPS from Fungi Strain PH1008 Isolated from Mangrove on Immune Function in Mice

WANG Ying1，2，BEI Ning3，WANG Yong-xia2，PEI Hua2，*，YANG Wen2，RAO Lang-yu2
（1.School of Basic Medical Science，Central South University，Changsha 410013，Hunan，China；2.School of Tropical Medicine and Laboratory Medicine，Hainan Medical University，Haikou 571199，Hainan，China；3.Hainan Provincial Geriatric Hospital，Haikou 571100，Hainan，China）

Research on EPS from fungi strain PH1008 isolated from mangrove on immune function in mice to evaluate its value in terms of immune function.Effects of EPS on the proliferation of murine splenic cell and its cytolytic activity were detected by MTT assay；Every mouse were administrated with different concentrations EPS through stomach for 28 days，calculate the indices of thymus，spleen and liver to investigate the effects of EPS on immune function in vitro.EPS stimulated the proliferation of spleen cell promoted its cytolytic activity in vitro，increased body index in mice and enhance the innate immune function.EPS from fungi strain PH1008 isolated from mangrove enhanced immune function in mice.

Fungi；EPS；Spleen；NK cell

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.12.005

2015-02-14

國家自然科學(xué)基金資助（31260225）；海南省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（309032）

王英（1979—），女（漢），實(shí)驗(yàn)師，在讀碩士，研究方向：病原生物學(xué)與免疫。