莖瘤芥乳酸菌飲料穩定性研究及工藝條件優化

徐安書，郭健，殷永玲

（1.重慶工貿職業技術學院，重慶408000；2.重慶市涪陵區農產品質量安全檢測管理站，重慶408000）

莖瘤芥乳酸菌飲料穩定性研究及工藝條件優化

徐安書1，郭健2，殷永玲1

（1.重慶工貿職業技術學院，重慶408000；2.重慶市涪陵區農產品質量安全檢測管理站，重慶408000）

基于莖瘤芥胡蘿卜混合汁乳酸菌飲料穩定性研究基礎上進行工藝條件優化，進一步研究發酵過程中酸度對感官品質和組織狀態的影響，采用四因素三水平正交實驗，研究菌種比例、接種量、發酵溫度、發酵時間對發酵過程中穩定性的影響，根據沉淀率的大小判定其穩定性，試驗結果：保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌比例為1∶1，母發酵劑接種量3%，發酵溫度37℃，發酵時間12 h，均質壓力20 MPa，均質溫度在30℃～40℃之間，2次均質，效果更好，最后添加復合穩定劑耐酸羧甲基纖維素鈉CMC0.3%+黃原膠0.01%。

莖瘤芥；胡蘿卜；乳酸菌；穩定性；優化工藝

莖瘤芥（Brassica juncea var.tumida Tsen et Lee）為十字花科（Cruciferae）芥屬（Brassica）芥菜種的一個變種，是榨菜加工的原料作物。莖瘤芥乳酸菌飲料是以涪陵地產的莖瘤芥為主要原料、添加胡蘿卜汁（兩種汁比例6∶4），脫脂乳4%，母發酵劑接種量3%，發酵溫度37℃，發酵時間12h，兩次均質，均質壓力20MPa，均質溫度30℃～40℃，殺菌溫度100℃，殺菌時間10min，最后添加殺菌后的穩定劑［1］。綜合蔬菜原料的營養、保健成分與乳酸菌的獨特的保健功能，制成一種既營養又能提高莖瘤芥附加值的一種營養保健食品，該飲料既具有蔬菜天然色素和營養、較高活性乳酸菌數量，又具有乳酸發酵的風味和特點［2］。糖酸比合適，口感協調，衛生指標合格，制品可保持一年以上。

通過添加乳酸菌發酵后的莖瘤芥胡蘿卜乳酸菌飲料綜合蔬菜原料的營養、保健成分與乳酸菌的獨特的保健功能，制成一種既營養又能提高莖瘤芥附加值的一種營養保健食品，深受消費者的喜愛。然而，我們在莖瘤芥葉胡蘿卜混合汁復合乳酸菌飲料的穩定性研究基礎上進一步對發酵過程中酸度的控制及發酵工藝條件進行了進一步優化，得到穩定性較強的發酵工藝參數，為該類型產品工業化生產與研究提供理論依據。研究發現發酵過程中酸度是主要影響穩定性的因素之一，而酸度的產生又跟菌種種類及比例、發酵溫度和時間、接種量等因素有直接關系，其中發酵時間影響最大。

1材料與方法

1.1材料

嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）簡寫St、德氏乳桿菌保加利亞亞種（Lactobacillus delbrueckiisubsp）簡寫Ld：購于中國食品發酵工業研究院；MRS培養基：市售；涪陵地產莖瘤芥；胡蘿卜、食用級蔗糖和葡萄糖、脫脂奶粉：市售；氫氧化鈉，碳酸鈉，pH緩沖液（鄰苯二甲酸氫鉀）、羧甲基纖維素鈉果膠酶（活力≥500 000 U/g）：成都科龍；穩定劑均為食品級；檸檬酸、VC、黃原膠、氯化鈉：均由重慶工貿職業技術學院生物化學工程系實驗室提供。

1.2儀器

PX-300B型生化培養箱：上海躍進醫療器械廠；HG72-1恒溫干燥箱：北京市朝陽區來廣營醫療器械廠；梅特勒AR2140電子天平：奧豪斯國際貿易（上海）有限公司；生物顯微鏡（重慶奧特（B203LED）10×、40×、100×（平常消色差目鏡）；CD-222KSA低溫冰箱：青島海爾股份有限公司；SW-CJ-1FD潔凈工作臺：蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司；LDZX-50KB立式壓力蒸汽滅菌鍋：上海申安醫療器械廠；pHS-25數字式pH計：上海日島科學儀器有限公司；GYB60-6S高壓均質機：上海東華高壓均質機廠；飛利浦HR1871榨汁機、HH-1數顯恒溫水浴鍋：常州澳華儀器有限公司；LG10-2.4A高速離心機等。

1.3方法

1.3.1菌種活化和馴化

將Ld和St按Ld∶St（1∶1、1∶2、2∶1）混合菌種分別接種到已滅菌并冷卻的10%脫脂乳（NFM）培養基中，放置43℃培養24 h～48 h，傳代3次～4次，取4 h內凝乳的酸奶。此時乳酸菌活力已達要求（平板計數法測定乳酸菌活菌數）。

將3種比例的混合菌種分別在脫脂乳和混合果蔬汁比例為9∶1的培養基中培養，再至兩者比例為8∶2的培養基培養。直到兩者比例為1∶9的培養基培養，最后用純混合蔬菜汁培養。每次培養后均測定其乳酸菌數達到1.0×107CFU/mL以上，反復多次，至產酸較快生長良好為止，即得到3種比例混合種子液。

1.3.2蔬菜汁制備

1.3.2.1莖瘤芥汁

選擇無病蟲害的莖瘤芥（青菜頭）→清洗→去皮筋→榨汁→四層以上沙布過濾→離心機離心→取上清液。

1.3.2.2胡蘿卜汁

選擇無霉爛、色澤橙紅、肉厚、飽滿的胡蘿卜→清洗→切塊→0.2%檸檬酸+0.1%VC混合液煮沸6 min→加入新鮮1/2質量的水→打漿→0.05%果膠酶在50℃保溫液化酶解1 h→4層以上沙布過濾→離心機離心→取上清液［2］。

1.3.3母發酵劑的制備

蔬菜汁制備（莖瘤芥胡蘿卜混合汁配比6∶4）+4%蔗糖+4%脫脂乳→攪拌溶解→高溫殺菌（100℃，10 min）→迅速冷卻至40℃→分別接種（5%經馴化后Ld∶St按1∶1、1∶2、2∶1比例混合種子液）→恒溫培養（37℃，24 h）→分別測定其乳酸菌數達到要求→存放冰箱備用

1.3.4莖瘤芥胡蘿卜混合汁乳酸菌飲料工藝流程

1.3.5試驗設計方案

選取菌種比例（球菌：桿菌）、母發酵劑接種量、發酵溫度、發酵時間為研究因素，4種因素采用正交L9（34）試驗進行篩選，取樣品10 mL，經3 500 r/min離心15 min，測定沉淀量的多少判定其穩定性。設計結果見表1。

表1　莖瘤芥胡蘿卜混合汁乳酸菌飲料發酵L9（34）正交試驗因素水平表Table 1Tumorous stem mustard carrot juice beverage of lactobacillus fermentation for L9（34）orthogonal test table level factors

1.2.6穩定性測試方法［3］

離心沉淀率檢測：準確量取樣品10 mL加入離心管中，在3 500 r/min離心15 min，棄去上部溶液，準確稱取沉淀物重量，利用下列公式計算沉淀率。根據沉淀量的多少判定其穩定性，沉淀率越低，穩定性越好。

1.3.7乳酸菌數

MRS培養基平板計數法

1.3.8酸度

GB/T12456-2008食品中總酸的測定酸堿滴定法（°T測定：用0.1 mol/LNaOH直接滴定）。

1.3.9pH值

pHS-25數字式pH計直接計數。

1.3.10飲料基本參數

蛋白質含量≥0.7%，可溶性固形物13%，酸度DT=50，組織狀態呈均勻細膩的乳淡黃色渾濁液，無異物，無分層現象。

2結果與分析

2.1發酵過程中酸度對穩定性的影響

將蔬菜汁（莖瘤芥汁∶胡蘿卜汁=6∶4）按比例混合后調pH6.3，殺菌（100℃，10 min），冷卻至40℃加入馴化后母發酵劑（Ld∶St=1∶1），接種量5%，設置6個恒溫發酵溫度，分別為37、38、39、40、41、42℃，分別測定12、24、36 h后的pH、滴定酸度，并進行感官品質和組織狀態評定，結果見表2。

表2　莖瘤芥胡蘿卜混合汁乳酸菌飲料發酵過程感官品質與組織狀態Table 2Tumorous stem mustard carrot juice mixed fermentation of lactic acid bacteria beverage process sensory quality and structure

由表2得知，隨著發酵時間延長，產酸量增多，pH下降，沉淀越多，流動性越來越差；飲料顏色由淡乳黃變黃褐色，香氣由榨菜香變酸餿氣味。在莖瘤芥乳酸菌發酵過程中，乳酸菌利用原料中乳糖作為其生長增殖的能量來源，在乳酸菌增殖過程中，其中的各種酶和酸將乳糖轉化成乳酸。乳酸的形成使乳清蛋白和酪蛋白復合體越來越不穩定。當體系內的pH達到酪蛋白的等電點時（pH4.6～4.7），酪蛋白膠粒開始聚集沉降，逐漸形成一種蛋白質網絡立體結構，其中包含乳清蛋白、脂肪和水溶液部分。這種變化使原料乳變成了半固體狀態的凝膠體—酸乳，使乳飲料粗糙、不細膩，有沙礫狀結構產生［4］。因此，影響莖瘤芥乳酸菌飲料穩定性因素之一是控制好發酵過程中酸度，而酸度的控制又與原料殺菌溫度、菌種種類與接種量、發酵溫度等因素有關［5］，所以說發酵過程的好壞直接影響到乳酸菌乳飲料的風味和穩定性。

2.2莖瘤芥胡蘿卜混合汁乳酸菌飲料最佳發酵液正交試驗結果

通過正交試驗確定莖瘤芥胡蘿卜混合汁乳酸菌飲料發酵過程中最佳菌種比例、母發酵劑接種量、發酵溫度和發酵時間，試驗結果見表3和圖1。

表3　莖瘤芥胡蘿卜混合汁乳酸菌飲料最佳發酵液正交試驗表Table 3Tumorous stem mustard carrot juice beverage fermented liquid of lactic acid bacteria optimum orthogonal test table

圖1　正交試驗K值線形圖Fig.1Orthogonal test K value of linear

由表3可以看出，方差分析結果優水平配方為A2B1C1D1，即菌種比例為∶嗜熱鏈球菌∶保加利亞乳桿菌=1∶1，母發酵劑接種量為3%，發酵溫度37℃，發酵時間12 h。從極差分析中可見，影響試驗的4個因素的大小順序是D>A>B>C，即對莖瘤芥乳酸菌飲料風味穩定性影響最大的是發酵時間（RD=9.4），其次是菌種比例（RA=1.2），而接種量和發酵溫度有一定溫度，但影響不是很大。正交試驗K值線性圖如圖1。

由圖1可以看出，隨著發酵溫度的增高和發酵時間的延長，沉淀率明顯增大，而且增減幅度較大，說明發酵時間是影響莖瘤芥乳酸菌飲料穩定性最大因素之一；隨著桿菌和球菌比例的增大，沉淀率逐漸下降，直到相等，當桿菌大于球菌時，沉淀率又會上升，接種量在一定量內隨著接種量增大，沉淀率有一定程度上升，但變化不大。

綜上所述，最有利于莖瘤芥乳酸菌飲料穩定性的發酵條件是A2B1C1D1，即菌種比例為∶保加利亞乳桿菌∶嗜熱鏈球菌=1∶1，母發酵劑接種量為3%，發酵溫度37℃，發酵時間12 h。添加復合穩定劑（CMC0.3%+黃原膠0.01%），均質壓力15 MPa～25 MPa，均質溫度在30℃～40℃之間，兩次均質，效果更好。

3結果與討論

3.1發酵過程中酸度對穩定性的影響

乳酸菌乳飲料發酵過程中，當pH降至4.6～5.3時，酪蛋白就失去穩定性，酪蛋白粒子發生凝集，分子團變大，最后形成沉淀。整個發酵過程的好壞直接影響酪蛋白顆粒的大小，而乳酸菌乳飲料與酸奶粒子直徑的大小有關。

3.2發酵時間和溫度對穩定性的影響

發酵時間和溫度是影響莖瘤芥乳酸菌飲料穩定性的重要因素之一，溫度低，發酵飲料細膩，有利于穩定性的提高。但發酵溫度過低，發酵速度過慢，會引起污染，產生異味，導致發酵失敗，采用37℃發酵12 h，飲料的安全性和穩定性較好。

3.3菌種比例、種子液接種量對穩定性影響

菌種比例對乳酸菌飲料的穩定性影響較小，乳酸菌種一般含嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌，球菌和桿菌的比例大多為1∶1或2∶1，由于桿菌分解蛋白質的活性強，產酸能力也強，使乳酸菌飲料酸度上升過快，牛乳中的結合水就會減少，蛋白質粒子凝集過快，造成發酵乳飲料的組織結構粗糙，顆粒大小不均勻［4］。經過實踐證明，球菌與桿菌比例以1∶1更好。

接種量大小直接影響發酵周期。采用較大的接種量可以縮短發酵周期，減少染菌的機會，這是由于種子量多，同時種子液中含有大量體外水解酶類，有利于對基質的利用和產物的合成，并且生產菌迅速占據了整個培養環境，減少了雜菌生長的機會。但是，如果接種量過大，往往使菌絲生長過快，培養液黏度增加，造成溶解氧不足，穩定性下降，從而影響產物的合成。因此，采用適宜接種量，即可以縮短發酵時間，提高飲料穩定性，同時減少染菌的機會。

［1］徐安書，張洪禮，何軍.莖瘤芥胡蘿卜混合汁乳酸菌飲料穩定性研究［J］.食品研究與開發，2013，13（34）：62-66

［2］徐安書，胡敏，何軍.莖瘤芥葉胡蘿卜混合汁復合乳酸菌發酵飲料的研制［J］.食品科學，2012，14（33）：321-325

［3］王善松，丁泉水.乳酸菌飲料穩定性研究［J］.中國乳品工業，2006，34（6）：58-60

［4］張洪穎，秦立虎.乳酸菌乳飲料的不穩定性及其解決對策［J］.乳品工業，2006（6）：52-54

［5］王帥.酸度對發酵奶品質的影響［J］.科技信息、基礎理論研究，45-46

Tumorous Stem Mustard Lactic Acid Bacteria Beverage Stability Research and Process Conditions Optimization

XU An-shu1，GUO Jian2，YIN Yong-ling1
（1.Biochemistry Engineering Department，Chongqing Industry&Trade Polytechnic，Chongqing 408000，China；2.Fuling Wahaha Beverage Company Limited，Chongqing 408000，China）

Tumorous stem mustard carrot juice lactic acid bacteria beverage stability study on the basis of the optimization of process conditions based on the further study of the effect of acidity and fermentation process on the sensory quality and organizational status，using four factors and three levels orthogonal experiment to study the effect of proportion，strain，inoculation，fermentation temperature and fermentation time on the stability of the fermentation process，according to the precipitation the size of rate to determine its stability，the results show that：the Lactobacillus bulgaricus and Streptococcus thermophilus ratio 1∶1，mother culture inoculation amount 3%，fermentation temperature of 37℃，fermentation time 12 h，homogenization pressure 20 MPa，homogeneous temperature between 30℃-40℃，the better the two homogeneous，effect，finally adding compound stabilizer acid Suo Jiaji cellulose sodium CMC0.3%+0.01%xanthan gum.

tumorous stem mustard；carrot；lactic acid bacteria；stability；process optimization

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.12.017

2015-02-09

重慶市教委2014年度科學技術研究項目（KJ1403401）

徐安書（1964—），女（漢），教授，學士，研究方向：微生物及微生物發酵技術，食品加工。