固相萃取-LC-MS/MS同時測定牛奶中7種β2-受體激動劑

馬立利，劉艷，賈麗，馮月超，張春梅，范筱京

（北京市理化分析測試中心，北京市食品安全分析測試工程技術研究中心，北京100089）

固相萃取-LC-MS/MS同時測定牛奶中7種β2-受體激動劑

馬立利，劉艷*，賈麗，馮月超，張春梅，范筱京

（北京市理化分析測試中心，北京市食品安全分析測試工程技術研究中心，北京100089）

建立了牛奶中7種β2-受體激動劑殘留量超高效液相色譜/串聯質譜的分析方法。牛奶樣品經40%甲醇溶液提取、乙酸鋅溶液蛋白沉淀、HLB固相萃取柱凈化后，以C18為分析色譜柱，甲醇-0.1%甲酸溶液作為流動相進行梯度洗脫分離，采用多反應監測（MRM）模式測定。結果表明，7種β2-受體激動劑在0.04 μg/kg～4 μg/kg的濃度范圍內呈線性，其相關系數r2大于0.998，定量限在0.01 μg/kg～0.04 μg/kg，加標回收率為66.8%～99.2%，相對標準偏差（RSD）范圍為2.0%～15.8%。本方法靈敏度高，準確度好，對實際樣品進行了測試分析，均獲得了滿意的結果。

β2-受體激動劑；牛奶；超高效液相色譜/串聯質譜

β2-受體激動劑是一類化學合成的苯乙醇胺類衍生物，它們的結構跟天然分泌的多巴胺、去甲腎上腺素、腎上腺素的結構相似。1988年，β2-受體激動劑被批準用于醫療和獸醫治療，主要用于防治哮喘、支氣管痙攣等疾病［1］。這類物質能夠促進蛋白沉淀［2］，具有營養重新分配和提高瘦肉率的作用，被廣泛用做食品動物生產中的促生長添加劑［3-5］。然而，人體累計攝入此類藥物劑量超過一定值或食入高殘留量的內臟組織后，易出現毒副作用，如肌肉震顫、劇烈腹痛、心跳和呼吸加快等，對人體危害巨大［6］。因此，中國和歐盟都規定所有的β2-受體激動劑在動物飼養過程中嚴禁使用［7］。

農業部235號公告《動物性食品中獸藥最高殘留限量》規定在所有食用動物的所有可食組織中不得檢出此類藥物。歐盟、美國、日本等發達國家對動物性食品中克倫特羅和萊克多巴胺殘留制定了嚴格的限量要求，如歐盟規定牛奶中克倫特羅殘留量不得超過0.05 μg/kg。我們國家嚴格禁止將該類藥物給動物使用，并要求動物性食品中不得檢出［7-8］。

β2-受體激動劑在動物源食品中檢測方法較多。目前，國內外報道的確證方法主要有氣相色譜-質譜聯用法（GC-MS）、液相色譜-串聯質譜聯用法（LC-MS/ MS）等［9］。GC-MS法通常需要酰化、硼化，或三甲基硅烷化等復雜的衍生步驟，并且目前還未有一種衍生化試劑對所有的β2-受體激動劑有效；在衍生化過程中，還會產生其他的副產物，對目標物的定量分析有一定干擾［10］。而LC-MS/MS檢出限較低，靈敏度較高，可以準確定性，現在已成為檢測此類物質的首選［11］。本文通過簡化前處理步驟，結合UPLC-MS/MS，建立了牛奶中7種β2-受體激動劑進行的檢測方法，方法具有簡單、高通量的特點，滿足殘留分析的要求。

1材料與方法

1.1儀器與試劑

UPLC-MS/MS，配備有ACQUITY超高效液相色譜儀、Xevo TQ-S串聯四級桿質譜儀：Waters公司；HY-5回旋式振蕩器：江蘇金壇市宏華儀器廠；渦旋儀：江蘇海門其林貝爾儀器制造有限公司；Elix 10 Milli-Q超純水系統：美國Millipore公司；固相萃取裝置：美國Agilent公司；高速冷凍離心機（Hitachi，CR22GⅢ）；恒溫水浴氮吹儀，包括N-EVAPTM112氮氣蒸發儀、OA-SYSTM加熱裝置：Organomation Associates公司；ACQUITY UPLCBEHC18色譜柱（2.1×50mm，1.7μm，Waters公司）；HLB固相萃取住（Waters Oasis，500mg/6 mL）；0.22 μm微孔濾膜：天津津騰科技有限公司。

溴布特羅（Brombuterol）、富馬酸福莫特羅（Formoterol fumarate dihydrate）、馬賁特羅（Mapenterol）、鹽酸馬布特羅（Mabuterol hydrochloride）、鹽酸萊克多巴胺（Ractopamine hydrochloride）、鹽酸克倫特羅（Clenbuterol hydrochloride）、鹽酸妥布特羅（Tulobuterol hydrochloride）標準品（非鹽形式結構見圖1）購于Dr. Ehrenstorfer公司；甲醇、甲酸（色譜純，美國Fisher公司）；乙酸鋅、亞鐵氰化鉀（分析純）：國藥集團化學試劑有限公司。

1.2樣品處理

1.2.1樣品提取

圖1　β2-受體激動劑的結構式Fig.1Chemical structures of β2-agonists

準確稱取5 g牛奶樣品于50 mL塑料離心管中，加入15 mL 40%甲醇溶液，渦旋1 min，振蕩提取30 min。加0.5 mL乙酸鋅溶液（21.6 g/100 mL），渦旋1 min，10 000 r/min離心10 min，轉移至另一離心管中，再加15 mL 40%甲醇溶液溶解殘渣，渦旋1 min，振蕩提取20 min，10 000 r/min離心10 min。合并提取液，待凈化。

1.2.2樣品凈化

將HLB固相萃取小柱放入固相萃取裝置的指定位置，依次用6mL甲醇、6mL水活化。取提取液全部過柱，用3 mL 5%甲醇溶液淋洗，6 mL甲醇洗脫至10 mL離心管中。在氮吹濃縮裝置上于50℃吹干，用甲醇-0.1%甲酸溶液（體積比為1∶9）定容至1mL，過0.22μm微孔濾膜后待測。

1.3儀器分析條件

1.3.1液相色譜條件

柱溫：30℃；流速：0.3 mL/min；進樣量：10 μL；流動相A為甲醇，流動相B為0.1%甲酸溶液；二元梯度分離，梯度順序：0 min～5min，95%～70%B；5 min～9 min，70%～10%B；9min～10min，10%～95%B；10min～12 min，95%B。

1.3.2質譜條件

電噴霧電離（ESI+）離子源；源溫為150℃；毛細管電壓3.2 kV；脫溶劑溫度500℃；脫溶劑氣（氮氣）流量為900 L/Hr。7種目標物的采集參數列于表1。

表1　β2-受體激動劑的質譜采集條件Table 1Optimization conditions of β2-agonists in mass spectrometric analysis

續表1β2-受體激動劑的質譜采集條件Continue table 1Optimization conditions of β2-agonists in mass spectrometric analysis

2結果與討論

2.1質譜與色譜條件的優化

2.1.1液相分離條件的優化

本實驗考察了不同溶劑的分離效果，包括甲醇-0.1%甲酸、甲醇-0.1%甲酸-5 mmol/L乙酸銨、甲醇-5 mmol/L乙酸銨、乙腈-0.1%甲酸、甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸7種流動相對分析物的分離度和響應值的影響。最終確認甲醇-0.1%甲酸體系具有比較理想的分離度和響應值。

考察了不同的定容溶劑：甲醇-0.1%甲酸（10∶90）、甲醇-水（10∶90）、甲醇。其中甲醇-水中目標物的響應值與甲醇-0.1%甲酸無明顯區別，但是后者的峰形比前者更對稱；選用甲醇為溶劑時，響應值較低。因此，最終選擇甲醇-0.1%甲酸（10∶90）為定容溶劑，使目標具有良好的響應值和峰形，具體色譜圖如圖2所示。

圖2　7種β2-受體激動劑的色譜圖Fig.2Chromatography of β2-agonists

2.1.2質譜條件的確定

由于所購標準品為馬布特羅、萊克多巴胺、克倫特羅、妥布特羅幾種受體激動劑的鹽酸鹽形式，調諧時，母離子應為［M-HCl+H］+。富馬酸福莫特羅為富馬酸鹽，母離子為［1/2［M-fumaric-2H2O］+H］+。

2.2提取與凈化條件的優化

2.2.1提取條件的優化

提取溶劑對提取效果有一定的影響。本實驗中，準確稱取5 g牛奶樣品，加標水平為1 μg/kg，分別考察10%、20%、30%、40%甲醇溶液提取效率，見圖3。

采用40%甲醇溶液提取時6種分析物的回收率較其他3種溶劑高；妥布特羅回收率較低。加入0.5 mL乙酸鋅溶液沉淀，10%甲醇溶液提取離心后有少量蛋白漂浮，甲醇含量越小，沉淀效果越差。定容過膜后，40%甲醇溶液提取的顏色最淺，其他呈淡黃色。因此，綜合考慮，選用40%甲醇溶液作為提取溶劑。

2.2.2沉淀溶劑及體積的優化

當選用40%甲醇溶液提取，經10 000 r/min離心10 min后，體系中仍有大量蛋白質。考慮到乙酸鋅和亞鐵氰化鉀具有沉淀蛋白的作用［12］，本實驗分別考察了不同體積的乙酸鋅溶液（21.6 g/100 mL）、亞鐵氰化鉀溶液（10.6 g/100 mL）的沉淀效果：0.5、1.0 mL和2.0 mL乙酸鋅溶液、0.5、1.0 mL和2.0 mL亞鐵氰化鉀溶液，以及1.0 mL乙酸鋅溶液和1.0 mL亞鐵氰化鉀溶液的混合溶液被考察。結果表明，3種只加亞鐵氰化鉀溶液方式，樣品處理液仍然十分渾濁，蛋白沉淀效果較差；而加入乙酸鋅溶液效果良好，加入0.5 mL就能達到要求。因此，本實驗采用0.5 mL乙酸鋅溶液沉淀體系中的蛋白質。

2.3分析方法的評價

2.3.1基質效應

基質是樣品中被分析物以外的組分，常對目標物的分析有顯著干擾，并影響結果的準確性，這些影響和干擾被稱為基質效應。串聯質譜以特異性強著稱，但越來越多的數據表明質譜檢測同樣需要注意避免基質效應。

基質效應可影響檢出限（LOD）、定量下限（LOQ）、線性、準確度和精密度。Matuszewski等［13］首次提出可以對基質效應的強度進行定量的評價方法，分別測定提取后添加目標物與流動相中添加同樣濃度目標物的離子響應強度，計算二者相對比值來評價基質效應。若比值小于1.0，說明基質的存在對目標物的響應產生了抑制作用；若大于1.0，說明基質對目標物的響應產生增強作用；若等于1.0，說明不存在基質效應，但在實際中，很難得到這樣的結果，一般相對比值在0.85～1.15之間則認為基質效應不明顯［14-15］。

參照Du等［3］對基質效應的評價，利用基質標準曲線對溶劑標準曲線斜率的比值，評價本方法的基質效應。7種分析物的斜率之比為0.836～1.112（見表2），除馬賁特羅（0.836）外，本方法對對其他6種β2-受體激動劑基質效應不明顯；而牛奶基質對馬賁特羅的響應有一定的抑制作用，由于差別不是很大，綜合其他目標物的結果，7種待測物利用溶劑標準曲線定量。

表2　基質標準曲線和溶劑標準曲線的比較Table 2Comparison of matrix-matched calibration and solvent calibration

2.3.2方法的定量限及回收率

方法的LOQ按照實際檢測的樣品峰高與噪音的峰高比S/N>10計算。并在最佳提取條件和色譜條件下，考察了3個不同加標濃度（0.04、0.2、2 μg/kg）牛奶樣品的回收率。方法的LOQ、回收率和相對標準偏差結果見表3。

2.4樣品分析

將市場上購買的10份牛奶樣品，在最優提取條件下進行處理，并通過超高效液相色譜/串聯質譜進行分析，所有牛奶樣品均未檢出目標物。

表3　β2-受體激動劑的定量限、3個添加水平的回收率和相對標準偏差Table 3LOQ，recoveries and RSD for target compounds from milk in three spiked levels

3結論

本研究建立了牛奶中7種β2-受體激動劑殘留的固相萃取-超高效液相色譜/串聯質譜測定方法。采用40%甲醇溶液提取，乙酸鋅溶液沉淀蛋白，HLB固相萃取柱凈化。分析過程中只用了甲醇和甲酸兩種有機溶劑，具有綠色環保、處理簡單、提取效率高等優點，能夠滿足牛奶中β2-受體激動劑殘留快速檢測的特點。

［1］Ramos F J D.β-Agonist extraction procedures for chromatographic analysis［J］.J Chromatogr A，2000，880：69-83

［2］Juan C，Igualada C，Moragues F，et al.Development and validation of a liquid chromatography tandem mass spectrometry method for the analysis of β-agonists in animal feed and drinking water［J］.J Chromatogr A，2010，1217：6061-6068

［3］Du X D，Wu Y L，Yang H J，et al.Simultaneous determination of 10β2-agonists in swine urine using liquid chromatography-tandem mass spectrometry and multi-walled carbon nanotubes as a reversed dispersive solid phase extraction sorbent［J］.J Chromatogr A，2012，1260：25-32

［4］劉敏，劉戎，王立琦，等.豬肝中β-受體激動劑多殘留的樣品前處理方法比較及同時檢測［J］.分析測試學報，2012，31（3）：290-295

［5］金玉娥，郭德華，鄭燁，等.液質聯用儀測定動物源性食品中11種β2-受體激動劑的研究［J］.質譜學報，2007，28（4）：193-201

［6］白凌，陳大舟，李蕾.液相色譜-質譜法檢測肝臟中5種β-受體激動劑［J］.質譜學報，2008，29（1）：10-12

［7］Li C，Wu Y L，Yang T，et al.Simultaneous determination of clenbuterol，salbutamol and ractopamine in milk by reversed-phase liquid chromatography tandem mass spectrometry with isotope dilution［J］.J Chromatogr A，2010，1217：7873-7877

［8］沈建忠，江海洋.畜產品中β-受體激動劑殘留及其危害［J］.中國動物檢疫，2011，28（6）：27-28

［9］孫雷，張驪，朱永林，等.超高效液相色譜-串聯質譜法檢測動物源性食品中殘留的9種β-受體激動劑［J］.色譜，2008，26（6）：709-713

［10］Lee H B，Sarafin K，Peart T E.Determination of β-blockers and β2-agonists in sewage by solid-phase extraction and liquid chromatography-tandem mass spectrometry［J］.J Chromatogr A，2007，1148：158-167

［11］李瑩瑩，宋永青，郭文萍，等.超高效液相色譜-串聯質譜方法同時測定豬肉中7種β-受體激動劑殘留量［J］.肉類研究，2012，26（5）：25-29

［12］中華人民共和國衛生部.GB 21703-2010乳和乳制品中苯甲酸和山梨酸的測定［S］.北京：中國標準出版社，2010：1-4

［13］Matuszew S K，Constanzer M L，Chavez-eng C M.Strategies for the assessment of matrix effect inquantitative bioanalytical methods based on HPLC-MS/MS［J］.Anal Chem，2003（75）：3019-3030

［14］王立琦，曾振靈，束建花，等.液相色譜-電噴霧串聯質譜測定豬組織中β-興奮劑殘留的基質效應［J］.分析化學研究簡報，2012，40（9）：1445-1449

［15］王立琦，賀利民，曾振靈，等.液相色譜-串聯質譜檢測獸藥殘留中的基質效應研究進展［J］.質譜學報，2011，32（6）：321-332

Solid Phase Extraction Coupled with Ultra Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry for the Determination of 7 β2-agonists in Milk

MA Li-li，LIU Yan*，JIA Li，FENG Yue-chao，ZHANG Chun-mei，FAN Xiao-jing
（Beijing Center for Physical and Chemical Analysis，Beijing Engineering Research Center of Food Safety Analysis，Beijing 100089，China）

A simple and inexpensive pretreatment procedure was developed for 7 β2-agonists（brombuterol，formoterol，mapenterol，mabuterol，ractopamine，clenbuterol，tulobuterol）in milk.The samples were extracted with 40%methanol in water，and then Oasis HLB solid phase extraction（SPE）cartridges were used for cleanup.The analytes were quantified by ultra performance liquid chromatography coupled with electrospray ionisation tandem mass spectrometry（UPLC-ESI-MS/MS）operating in positive multiple-reaction mode（MRM）.Competent linearity was found for all target compounds with linear regression coefficients（R2）higher than 0.998.The limit of quantification ranged from 0.01 μg/kg to 0.04 μg/kg.Average recoveries spiked into raw milk were in the range from 66.8%to 99.2%with associated RSD values from 2.0%to 15.8%under the selected conditions.The method is rapid，cost-effective and can meet the requirements for identification and quantification of the β2-agonists in milk．

β2-agonists；milk；UPLC-MS/MS

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.12.022

2014-02-20

北京市優秀人才計劃（No.2011D002022000005）；北京市科學技術研究院市級財政項目（PXM2014_178305_000008）

馬立利（1981—），女（漢），助理研究員，碩士，研究方向：食品分析與檢測技術。