Dis-SPE-HPLC-DAD檢測(cè)水果中有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥

董祥芝，安鳳秋，李慶，同幟

（西安工程大學(xué)環(huán)境與化學(xué)工程學(xué)院，陜西西安710048）

Dis-SPE-HPLC-DAD檢測(cè)水果中有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥

董祥芝，安鳳秋，李慶，同幟

（西安工程大學(xué)環(huán)境與化學(xué)工程學(xué)院，陜西西安710048）

建立了高效液相色譜-二極管陣列檢測(cè)水果中涕滅威、西維因、異丙威、仲丁威、馬拉硫磷等5種有機(jī)磷和氨基甲酸酯農(nóng)藥的方法。前處理方法采用分散固相萃取，樣品以乙腈提取，經(jīng)無(wú)水硫酸鎂和氯化鈉鹽析，PSA凈化后，進(jìn)行HPLC-DAD檢測(cè)。以甲醇/水（體積比70/30）為流動(dòng)相，流速1 mL/min。DAD檢測(cè)器的波長(zhǎng)設(shè)定為210 nm。5種農(nóng)藥在0.04 μg/mL～4 μg/mL范圍內(nèi)線性相關(guān)系數(shù)均高于0.99，檢出限在0.057 μg/mL～0.60 μg/mL之間。樣品在0.2、0.4、2 μg/mL的加標(biāo)水平時(shí)，平均回收率為73.32%～93.12%，RSD為3.46%～9.36%（n=6）。與傳統(tǒng)固相萃取方法相比，分散固相萃取具有簡(jiǎn)便、省時(shí)、高精確度和高回收率的優(yōu)點(diǎn)，可以作為水果中農(nóng)藥殘留的日常檢測(cè)方法。

分散固相萃取；HPLC-DAD；有機(jī)磷；氨基甲酸酯

氨基甲酸酯和有機(jī)磷農(nóng)藥是在蔬果中使用率較高的農(nóng)藥品種，經(jīng)常用于提高農(nóng)作物的產(chǎn)量，但是它們?cè)谑吖械臍埩簦约八鶐?lái)的毒性已受到人們的廣泛關(guān)注。傳統(tǒng)的樣品前處理方法，如索氏提取［1］、溶劑提取［2］，超聲萃取［3］，以及常規(guī)的固相萃取［4-5］、基質(zhì)分散固相萃取［6-8］等技術(shù)，都存在著用時(shí)長(zhǎng)、所需溶劑多、易造成二次污染的缺點(diǎn)。分散固相萃取最早是由Anastassiades等在2003年提出的［9］，因其快速（Quick）、簡(jiǎn)單（Easy）、低廉（Cheap）、高效（Effective）、耐用（Rugged）、安全（Safe）等特性，又被稱為QuEChERS法，被美國(guó)農(nóng)業(yè)部定為最新農(nóng)藥殘留檢測(cè)方法［10-12］。

由于有機(jī)磷和氨基甲酸酯的熱穩(wěn)定性相差較大，不宜使用GC同時(shí)進(jìn)行分離。但通過(guò)LC，無(wú)需衍生，可以同時(shí)對(duì)有機(jī)磷和氨基甲酸酯農(nóng)藥進(jìn)行檢測(cè)［13］。目前鮮見有使用分散固相萃取-液相色譜-二極管陣列檢測(cè)器（diode array detection，DAD）對(duì)水果中的有機(jī)磷和氨基甲酸酯農(nóng)藥進(jìn)行檢測(cè)的文章。因此，本文的目的在于建立分散固相萃取凈化，對(duì)水果中的有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥進(jìn)行HPLC-DAD分離和檢測(cè)的快速分析方法。

1材料與方法

1.1材料與儀器

農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)樣品涕滅威、西維因、異丙威、仲丁威、馬拉硫磷（100 μg/mL，甲醇溶劑，純度98%～99%）：中國(guó)農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)監(jiān)測(cè)機(jī)構(gòu)，在-20℃進(jìn)行保存；甲醇、乙腈（色譜純）：美國(guó)Fisher公司；無(wú)水硫酸鎂和氯化鈉（分析純）：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；PSA（乙二胺基-N-丙基，primary secondary amine）：德國(guó)Macherey-Nagel公司；超純水由實(shí)驗(yàn)室自制；水果樣品隨機(jī)購(gòu)于當(dāng)?shù)厥袌?chǎng)。

Agilent 1200型液相色譜儀：美國(guó)Agilent公司；艾科浦AWJ2-2009-U型超純水系統(tǒng)：重慶頤洋企業(yè)發(fā)展有限公司；5810R型高速冷凍離心機(jī)：德國(guó)eppendorf公司；BB332-A多功能食物攪拌機(jī)：佛山市順德伍發(fā)電器公司；QL-901型旋渦振蕩儀：海門市其林貝爾公司；HH-S4數(shù)顯恒溫水浴鍋：常州國(guó)華電器有限公司。

1.2色譜條件

色譜柱：vp-ODS-C18column（ZORBAXSB，4.6mm× 250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇/水（V/V，70/30）；流速：1 mL/min；柱溫：40℃；進(jìn)樣量：10 μL。DAD檢測(cè)器的波長(zhǎng)設(shè)定為210 nm。

1.3標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

先將標(biāo)準(zhǔn)溶液用甲醇配制成20 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，再根據(jù)需要用甲醇稀釋成4、2、0.4、0.2、0.04 μg/mL的混合標(biāo)樣，所有的試劑避光存放于-4℃冰箱中保存。

1.4樣品前處理

樣品經(jīng)食品攪拌機(jī)充分混合勻漿，準(zhǔn)確稱取5 g樣品于50 mL離心管中，加入10 mL乙腈后，在漩渦振蕩器中進(jìn)行充分?jǐn)嚢琛＜尤? g MgSO4和1 g NaCl后立即再振蕩1 min后，10 000 r/min離心10 min。取上清液1mL于1.5 mL的離心管中，并加入50 mg PSA和50 mg MgSO4，漩渦振蕩1 min后，10 000 r/min離心10 min。將上清液經(jīng)0.22 μm的濾膜過(guò)濾后，直接進(jìn)液相色譜進(jìn)行DAD檢測(cè)。

2結(jié)果與討論

2.1萃取溶劑及樣品量的選擇

甲醇、乙腈和丙酮是較為常用的農(nóng)殘萃取溶劑。但乙腈能夠有效的將水果表面的蠟質(zhì)物、脂肪及有機(jī)色素排除在外，飽和水層更容易與乙腈層實(shí)現(xiàn)分離，因此選擇乙腈作為萃取溶劑。

為實(shí)現(xiàn)最佳的萃取效率，優(yōu)化了樣品量和萃取溶劑的比例。選取10 mL MeCN，1 g MgSO4和1 g NaCl，分別對(duì)1、3、5、8、10 g樣品進(jìn)行萃取。離心后觀察到上清液的顏色均較為透明，說(shuō)明10 mL MeCN能夠滿足選定的樣品量的萃取。但樣品越多，上清液的轉(zhuǎn)移就越困難。因此，最終選擇5 g樣品和10 mL MeCN來(lái)進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。

2.2檢測(cè)波長(zhǎng)的確定

對(duì)5種農(nóng)藥進(jìn)行了紫外光譜掃描，以確定最佳吸收波長(zhǎng)。從圖1中可以看出5種農(nóng)藥的最佳紫外吸收波長(zhǎng)為270 nm。但有文獻(xiàn)分別選定210 nm和254 nm作為最佳吸收波長(zhǎng)進(jìn)行檢測(cè)［14-15］。因此本實(shí)驗(yàn)選擇210、245及270 nm 3種波長(zhǎng)進(jìn)行液相色譜DAD檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)在245 nm和270 nm處待測(cè)物的靈敏度非常差，見圖2。綜合考慮紫外響應(yīng)值和準(zhǔn)確性，選擇210nm作為最終檢測(cè)波長(zhǎng)。

圖1　5種農(nóng)藥紫外吸收光譜圖Fig.1UV spectra of pesticides

2.3分散固相萃取條件的優(yōu)化

圖2　3種不同波長(zhǎng)下的農(nóng)藥混標(biāo)色譜圖Fig.2Liquid chromatogram of standard mixture pesticides at different wavelengths

分散固相萃取是將凈化和干燥同時(shí)進(jìn)行的，MgSO4的作用主要有兩方面：一是促進(jìn)兩相分離；二是消除極性雜質(zhì)。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，MgSO4的量對(duì)西維因、仲丁威及馬拉硫磷的回收率影響不大。但是對(duì)涕滅威和異丙威，增加MgSO4的量，回收率會(huì)急劇下降。這是因?yàn)樘闇缤彤惐谒械娜芙舛纫h(yuǎn)遠(yuǎn)大于其他3種待測(cè)物，當(dāng)樣品的含水量較少時(shí)，加入過(guò)量的MgSO4反而容易成塊，從而帶來(lái)不必要的損失。所以最終選擇1 g MgSO4。

NaCl的鹽析作用可以讓水相趨于飽和來(lái)促進(jìn)水相和有機(jī)相的分離。由于待測(cè)物均為疏水性物質(zhì)，且已加入MgSO4將樣品中的水分吸附，因此1g NaCl即能達(dá)到最佳分離。

PSA同時(shí)具備伯胺和叔胺基團(tuán)，可以將基質(zhì)中的色素、有機(jī)酸、糖類等從待測(cè)物中提取出來(lái)。當(dāng)PSA由25 mg增加至100 mg時(shí)，涕滅威的回收率有所增加；馬拉硫磷的回收率有所下降。使用50 mg PSA時(shí)，異丙威和仲丁威的回收率最好（圖3）。因此最終選擇50 mg的PSA進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

圖3　PSA對(duì)回收率的影響（n=6）Fig.3The effect of PSA amount on the recovery of pesticides（n=6）

為徹底除去殘留的水分，在微量離心管中加入少量的MgSO4。分別加入50、100、150 mg MgSO4后發(fā)現(xiàn)西維因的回收率從74%增加到89%，但其他待測(cè)物回收率都有所下降。這是因?yàn)镸gSO4的加入量越大，上清液的移除越困難。因此最終選擇在微量離心管中加入50 mg MgSO4為最佳條件。

2.4方法線性關(guān)系

配制0.04 μg/mL～4 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，在優(yōu)化條件下建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，相關(guān)系數(shù)R2均高于0.99（表1）。檢出限（LODs）和檢測(cè)限（LOQs）分別在0.057 μg/mL～0.60 μg/mL和0.19 μg/mL～1.99 μg/mL之間。

表1　待測(cè)物的LOD、LOQ、線性方程及相關(guān)系數(shù)（n=6）Table 1LOD，LOQ（μg/mL）and standard curve for each analytes（n=6）

2.5加標(biāo)回收率和精密度

選擇有機(jī)蘋果作為對(duì)試驗(yàn)方法的驗(yàn)證基質(zhì)，因?yàn)橛袡C(jī)水果沒(méi)有添加任何農(nóng)藥或除草劑，加標(biāo)濃度為0.2、0.4、2 μg/mL 3個(gè)濃度水平，每個(gè)水平平行檢測(cè)6次。5種待測(cè)農(nóng)藥的加標(biāo)回收率為73.32%～93.12%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）在3.46%～9.36%之間（表2），結(jié)果表明本方法符合檢測(cè)要求。

表2　蘋果樣品中待測(cè)農(nóng)藥的加標(biāo)回收率、精密度（n=6）Table 2The spiked recoveries and precisions of the analytes pesticides in apple sample（n=6）

2.6實(shí)際樣品的應(yīng)用

將優(yōu)化后的試驗(yàn)方法用于市場(chǎng)購(gòu)買的不同種類、不同含水量和基質(zhì)的水果樣品，包括香蕉、橙子、梨和蘋果，結(jié)果見表3和圖4。香蕉作為熱帶水果，含水量最少，含糖量最多；橙子和蘋果有大量的有機(jī)酸；梨中有大量的碳水化合物。所有的農(nóng)藥樣品的回收率在70.79%～91.26%之間，RSD均低于10%。說(shuō)明本方法可以較好的應(yīng)用于所選擇的水果樣品。

3結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)建立了分散固相萃取-液相色譜對(duì)常見水果中涕滅威、西維因、異丙威、仲丁威、馬拉硫磷等5種有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥的檢測(cè)方法。樣品用乙腈提取，優(yōu)化了分散固相萃取的實(shí)驗(yàn)條件。樣品在0.2μg/mL～2μg/mL的加標(biāo)范圍內(nèi)，平均回收率在73.32%～93.12%，RSD為3.46%-9.36%（n=6）。并將本方法應(yīng)用于其他常見水果中，農(nóng)藥樣品的回收率在70.79%～91.26%之間，RSD均低于10%。實(shí)驗(yàn)證明該方法具有操作方便、耗時(shí)短、回收率高、重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn)，可以用于水果樣品中有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥的常規(guī)檢測(cè)方法。

表3　加標(biāo)0.4 μg/mL實(shí)際樣品中待測(cè)物的回收率和RSD（n=6）Table 3Recovery and RSD of the pesticides in different samples spiked with 0.4 μg/mL（n=6）

圖4　加標(biāo)香蕉樣品的農(nóng)藥色譜圖（0.4 μg/mL）Fig.4Typical chromatogram of pesticides in spiked banana sample（0.4 μg/mL）

［1］張麗，李楠，萬(wàn)延延，等.采用氣相色譜法測(cè)定土壤中有機(jī)磷農(nóng)藥［J］.污染防治技術(shù)，2011，24（2）：69-71，73

［2］李廣領(lǐng)，王建華，鄧天福，等.小麥子粒中五種有機(jī)磷農(nóng)藥多殘留分析方法研究［J］.湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，48（11）：2839-2842

［3］PAN J，XIA X X，LIANG J.Analysis of pesticide multi-residues in leafy vegetables by ultrasonic solvent extraction and liquid chromatography-tandem mass spectrometry［J］.Ultrasonics sonochemistry，2008，15（1）：25-32

［4］鄒力，同幟，董祥芝.固相萃取-液相色譜法測(cè)定水果中的氨基甲酸酯與有機(jī)磷農(nóng)藥［J］.紡織高校基礎(chǔ)科學(xué)學(xué)報(bào)，2011，24（4）：563-567

［5］YANG，X，ZHANG H，LIU Y，et al.Multiresidue method for determination of 88 pesticides in berry fruits using solid-phase extraction and gas chromatography-mass spectrometry：Determination of 88 pesticides in berries using SPE and GC-MS［J］.Food Chemistry，2011，127（2）：855-865

［6］董祥芝，張慧芬，同幟.基質(zhì)分散固相萃取-高效液相色譜檢測(cè)黃瓜中涕滅威和異丙威的農(nóng)藥殘留［J］.食品工業(yè)科技，2013，34（11）：310-312

［7］LIU L B，HASHI Y，QIN Y P，et al.Development of automated online gel permeation chromatography-gas chromatograph mass spectrometry for measuring multiresidual pesticides in agricultural products［J］.Journal of chromatography B，2007，845（1）：61-68

［8］CARRO，A M，LORENZO R A，F(xiàn)ERNáNDEZ F，et al.Multiresidue screening of chlorinated and brominated compounds from aquaculture samples using matrix solid-phased dispersion-gas chromatography-mass spectrometry［J］.Journal of chromatography A.2005，1071（1/2）：93-98

［9］ANASTASSIADES，M，LEHOTAY S J，?TAJNBAHER D，et al.Fast and easy multiresidue method employing acetonitrile extraction/partitioning and“dispersive solid-phase extraction”for the determination of pesticide residues in produce［J］.Journal of AOAC International，2003，86（2）：412-431

［10］LEANDRO，C C，F(xiàn)USSELL R J，KEELY B J.Determination of priority pesticides in baby foods by gas chromatography tandem quadrupolemass spectrometry［J］.Journal of chromatography A，2005，1085（2）：207-212

［11］于彥彬，譚丕功，曲璐璐，等.PSA分散固相萃取液相色譜柱后衍生熒光法測(cè)定蔬菜和水果中的13種氨基甲酸酯［J］.分析試驗(yàn)室，2009，28（11）：97-101

［12］王連珠，周昱，黃小燕，等.基于QuEChERS提取方法優(yōu)化的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定蔬菜中51種氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留［J］.色譜，2013，31（12）：1167-1175

［13］DAGNAC，T，CHAO M G，PULLEIRO P，et al.Dispersive solidphase extraction followed by liquid chromatography-tandem mass spectrometry for the multi-residue analysis of pesticides in raw bovine milk［J］.Journal of chromatography A，2009，1216（18）：3702-3709

［14］文君，孫成均，繆紅，等.高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定蔬菜中5種氨基甲酸酯類農(nóng)藥［J］.中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2007，17（6）：964-965，985

［15］馬莉莉，張承聰，吳曉波，等.固相萃取-高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定果蔬中9種農(nóng)藥殘留［J］.理化檢驗(yàn)-化學(xué)分冊(cè)，2010，46（7）：825-828

Determination of Organophosphorus and Carbamate Pesticides in Fruits Using HPLC-DAD with Dispersive Solid-Phase Extraction

DONG Xiang-zhi，AN Feng-qiu，LI Qing，TONG Zhi
（College of Environmental and Chemical Engineering，Xi'an Polytechnic University，Xi'an 710048，Shaanxi，China）

A method has been developed for five OPPs and Carbamate pesticides（aldicarb，carbaryl，isoprocarb，fenobucarb，malathion）in fruit samples by high performance liquid chromatography coupled with diode array detector（HPLC-DAD）.Dispersive solid-phase extraction（Dis-SPE）has been used for the preparation：the samples extracted with acetonitrile，salted-out by anhydrous magnesium sulfate and sodium chloride，then cleaned up with PSA，finally analyzed by HPLC-DAD.The mobile phase was methanol/water（V/V，70/30）at a total flow rate of 1 mL/min.The DAD wavelength was 210 nm.The method showed good linearity over the ranges of 0.04 μg/mL-4 μg/mL for five pesticides with correlation coefficients all above 0.99，and the limits of detection were 0.057 μg/mL-0.60 μg/mL.The average recoveries ranged from 73.32%to 93.12%with the RSD were 3.46%-9.36%（n=6）at spiked levels of 0.2，0.4，2 μg/mL.Compared with conventional SPE cleanup，dis-SPE greatly simplified and accelerated sample cleanup and less timeconsuming.Meanwhile，the high recoveries and good accuracy showed the optimal experimental conditions were satisfied.This method was applied to pesticide residue monitoring in fruits from local markets.

dispersive solid-phase extraction（dispersive SPE）；high performance liquid chromatographydiode array detector（HPLC-DAD）；organophosphorus；carbamate pesticides

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.12.025

2014-07-01

董祥芝（1984—），女（漢），工程師，碩士，主要從事分析化學(xué)、儀器管理工作。